Tên đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên dưa leo và biện pháp phòng trị bằng vi khuẩn đối kháng”

Tác giả: Nguyễn Thị Liên, Khóa: 2017

Ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 62420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Đắc Khoa - Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn phụ: TS. Nguyễn Thị Phi Oanh - Trường Đại học Cần Thơ

1. Tóm tắt nội dung luận án

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là bệnh quan trọng trên cây dưa leo. Sử dụng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng với mầm bệnh để phòng trị bệnh là biện pháp đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vì có tính bền vững, giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng và hệ sinh thái. Luận án này được thực hiện nhằm khảo sát đa dạng di truyền của mầm bệnh Colletotrichum spp. tại vùng Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), đồng thời phân lập và  tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây dưa leo có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum spp. và phòng trị được bệnh thán thư trên cây dưa leo.

Mười một chủng nấm được phân lập từ ruộng dưa leo bị bệnh thán thư đã được xác định là loài Colletotrichum lagenarium thông qua đặc điểm hình thái, kết quả thực hiện quy trình Koch và kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt (TUB-COF và TUB-COR) được thiết kế dựa vào trình tự vùng gen β-tubulin của nấm C. lagenarium.

Kết quả phân tích đa dạng di truyền của 11 chủng nấm bằng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) cho thấy số băng đa hình đạt tương ứng là 100% và 71-100% với hệ số tương đồng giữa các chủng nấm là 68-86% và 77-87%. Độc tính của 11 chủng nấm C. lagenarium có tương quan với kết quả phân tích đa hình về di truyền từ hai kỹ thuật RAPD và ISSR. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính đa biến từng bước (Stepwise Multiple Regression Analysis) cho thấy 11 allen RAPD và 2 allen ISSR có tương quan với tỷ lệ diện tích lá bệnh và chỉ số diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (Area Under the Disease Progress Curve).

Tổng số 135 chủng vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ cây dưa leo có khả năng đối kháng với mầm bệnh C. lagenarium. Phần trăm ức chế sự phát triển của sợi nấm trên đĩa thạch dao động từ 28,0-54,8%. Trong đó, 12 chủng vi khuẩn đối kháng mạnh có khả năng sinh ra các enzyme β-1,3-glucanase, cellulase, chitinase và protease để phân hủy vách tế bào mầm bệnh, sinh ra hợp chất siderophore để cạnh tranh sắt và có mang các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các lipopeptide kháng nấm. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn đối kháng này còn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA nên có khả năng kích thích sinh trưởng cây dưa leo.

Trong điều kiện nhà lưới, phun lên lá dưa leo ở thời điểm 1 ngày sau chủng bệnh (NSCB) hoặc phun kết hợp 1 ngày trước chủng bệnh và 1 NSCB với huyền phù 10⁸ tế bào/mL của các chủng vi khuẩn đối kháng CL16, CL8, ĐTII3.2, ĐTII3.3, ĐTII7 hoặc VL4.6 có khả năng giúp giảm bệnh thán thư khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Bên cạnh đó, ngâm hạt giống hoặc tưới vào đất ở thời điểm 1 ngày trước hoặc 1 ngày sau khi gieo (NSKG) với huyền phù 10⁸ tế bào/mL của chủng ĐTII3.3 hoặc VL4.6 cũng có khả năng giúp giảm bệnh.

Chủng VL4.6 được định danh là vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gen 16S rRNA kết hợp với các kỹ thuật vi sinh và sinh hóa.

Trong điều kiện ngoài đồng, kết hợp tưới vào đất ở thời điểm 7 NSKG và phun lên lá dưa leo ở thời điểm 1 ngày NSCB với huyền phù 10⁸ tế bào/mL của vi khuẩn B. amyloliquefaciens VL4.6 giúp giảm bệnh thán thư tương đương với thuốc hóa học Antracol 70WP (propineb).

2. Những kết quả mới của luận án

2.1. Xác định được nấm Colletotrichum spp. gây bện thán thư trên dưa leo tại vùng ĐBSCL là loài Colletotrichum lagenarium;

2.2. Thiết kế được cặp mồi chuyên biệt TUB-COF (5’-CTTCTGGTGCGTAGATAGAC-3’) và TUB-COR (5’-GGGCTATAGGATAACAAACC-3’) dựa vào trình tự vùng gen
β-tubulin để nhận diện nấm C. lagenarium;

2.3. Xác định được sự tương quan giữa độc tính của nấm C. lagenarium và kết quả phân tích đa hình về di truyền từ hai kỹ thuật RAPD và ISSR;

2.4. Tuyển chọn được 12 chủng vi khuẩn vùng rễ cây dưa leo có khả năng đối kháng mạnh với mầm bệnh C. lagenarium do sinh ra các enzyme β-1,3-glucanase, cellulase, chitinase và protease để phân hủy vách tế bào mầm bệnh, sinh ra hợp chất siderophore để cạnh tranh sắt và có mang các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các lipopeptide kháng nấm. Các chủng vi khuẩn đối kháng này còn kích thích sinh trưởng cây dưa leo do có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA;

2.5. Tuyển chọn và định danh được vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 (bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gen 16S rRNA kết hợp với các kỹ thuật vi sinh và sinh hóa) có khả năng giúp giảm bệnh thán thư trên dưa leo ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.

3. Khả năng ứng dụng trong thực tiễn, những vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

3.1. Khả năng ứng dụng trong thực tiễn

Cặp mồi chuyên biệt TUB-COF (5’-CTTCTGGTGCGTAGATAGAC-3’) và TUB-COR (5’-GGGCTATAGGATAACAAACC-3’) có thể được sử dụng để nhận diện mầm bệnh C. lagenarium, giúp phát hiện sớm mầm bệnh để triển khai các biện pháp phòng trị kịp thời;

Kỹ thuật RAPD và ISSR có thể được sử dụng để khảo sát độc tính của các chủng nấm C. lagenarium;

Chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens VL4.6 có khả năng phòng trị bệnh thán thư trên dưa leo trong thực tiễn sản xuất tại vùng ĐBSCL và các vùng trồng dưa leo khác.

3.2. Những vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

Khảo sát biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các lipopeptide kháng nấm;

Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học chứa chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens VL4.6 để ứng dụng phòng trị bệnh thán thư trên dưa leo;

Nghiên cứu phối trộn chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens VL4.6 với các chủng vi khuẩn đối kháng khác nhằm tăng hiệu quả phòng trị bệnh.

Dissertation title:   Genetic diversity of Colletotrichum spp. and biological control of cucumber anthracnose by soil antagonistic bacteria

- Field: Biotechnology                                                        Program code: 62420201

- PhD student:      Nguyễn Thị Liên                                  Year enrolled:  2017

- Supervisor:         Assoc. Prof. Nguyễn Đắc Khoa

- Co-supervisor:   Dr. Nguyễn Thị Phi Oanh

- Educational institution: Institute of Food and Biotechnology, Can Tho University

1. Summary of the dissertation

Anthracnose caused by Colletotrichum spp. is an important disease of cucumbers. Using antagonistic rhizobacteria against the pathogen to control the disease is a sustainable and eco-friendly control method. This study aims at investigating genetic diversity of the pathogen in the Mekong Delta of Vietnam and screening for antagonistic bacteria isolated from cucumber rhizospheres capable of controlling the disease.

A total of 11 fungal strains isolated from infected cucumber leaves under field conditions were identified as Colletotrichum lagenarium using their morphological characteristics, the Koch’s postulates and PCR with the specific primers TUB-COF and TUB-COR designed based on the β-tubulin gene sequence of C. lagenarium.

Results from genetic diversity analyses using RAPD and ISSR of the 11 pathogenic strains revealed 100% and 71-100% polymorphic bands where similarity coefficients were 68-86% and 77-87%, respectively. Correlations were observed between virulence of the fungal strains and the combination of RAPD and ISSR polymorphisms. Using the Stepwise Multiple Regression Analysis, 11 RAPD alleles and 2 ISSR alleles were shown to be associated with the percent infected leaf areas and the Area Under the Disease Progress Curve values.

A total of 135 antagonistic bacterial strains against C. lagenarium were found from cucumber rhizospheres. These strains inhibited 28.0-54.8% mycelial growth of  C. lagenarium on agar plates. Among those, the 12 strong antagonists were shown to be capable of producing β-1,3-glucanase, cellulase, chitinase and protease to degrade fungal cells, forming siderophores to compete for iron and possessing genes encoding antifungal lipopeptides. Furthermore, the cucumber growth-promotion effects were observed from these antagonistic strains including nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA synthesis.

Under net house conditions, foliar spraying at 1 day after pathogen inoculation (DAI) or a combination of foliar spraying 1 day before inoculation and 1 DAI using 10⁸ cells/mL suspensions of one of either the antagonistic strain CL16, CL8, ĐTII3.2, ĐTII3.3, ĐTII7 or VL4.6 reduced the disease significantly as compared to the untreated control. In addition, seed soaking or soil drenching at either 1 days before or 1 day after sowing (DAS) using 10⁸ cells/mL suspensions of either ĐTII3.3 or VL4.6 protected cucumbers against the disease.

The strain VL4.6 was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on microbiological and biochemical tests and the 16S rRNA gene sequence.

Under field conditions, a combination of soil drenching 7 DAS and foliar spraying 1 DAI using 10⁸ cells/mL suspensions of B. amyloliquefaciens VL4.6 reduced the disease similar to the chemical control (Antracol 70WP, propineb) did.

2. Originality of the dissertation

2.1. Colletotrichum lagenarium was identifed as the Colletotrichum species causing cucumber anthracnose in the Mekong Delta of Vietnam;

2.2. The specific primers TUB-COF (5’-CTTCTGGTGCGTAGATAGAC-3’) and TUB-COR (5’-GGGCTATAGGATAACAAACC-3’) were designed based on the β-tubulin gene sequence of C. lagenarium to detect this pathogen;

2.3. Correlations between virulence of C. lagenarium and the combination of RAPD and ISSR polymorphisms were identified.

2.4. A total of 12 strong antagonistic rhizobacteria  against C. lagenarium were found. They are capable of producing β-1,3-glucanase, cellulase, chitinase and protease to degrade fungal cells, forming siderophores to compete for iron and possessing genes encoding antifungal lipopeptides. These antagonistic strains also show cucumber growth-promotion effects including nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA synthesis;

2.5. Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 was identified based on microbiological and biochemical tests and the 16S rRNA gene sequence, which could control cucumber anthracnose under net house and field conditions.

3. Application potentials and suggestions for further studies

3.1 Application potentials

The specific primers TUB-COF (5’-CTTCTGGTGCGTAGATAGAC-3’) and TUB-COR (5’-GGGCTATAGGATAACAAACC-3’) could be used to detect C. lagenarium in early stages to effectively control cucumber anthracnose in practice;

RAPD and ISSR could be used to investigate virulence of C. lagenarium strains;

4. amyloliquefaciens VL4.6 could be used to control cucumber anthracnose in the Mekong Delta of Vietnam and other cucumber production areas.

3.2 Suggestions for further studies

Investigating expression of the genes encoding antifungal lipopeptides of the selected antagonistic rhizobacteria;

Studying bio-formulations of B. amyloliquefaciens VL4.6;

Testing the disease-reducing effects of mixtures of B. amyloliquefaciens VL4.6 and the other selected antagonistic rhizobacteria.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)