Tên đề tài: “Nghiên cứu tạo interferon ChIFN-α biểu hiện trên hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris và thử nghiệm trên các virus gây bệnh ở gà”.

Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Giang, Khóa: 2016

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 62420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống.

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Hồ Quảng Đồ - Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn phụ: TS. Nguyễn Đăng Quân - Trung tâm CNSH TP HCM

1. Tóm tắt nội dung luận án

Luận án “Nghiên cứu tạo interferon ChIFN-α biểu hiện trên hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris và thử nghiệm trên các virus gây bệnh ở gà” bao gồm 03 nội dung: (1) Tạo chủng nấm men Pichia pastoris mang gene mã hóa protein ChIFN-α có khả năng biểu hiện trên hệ thống lên men tự động dung tích 5L; (2) ChIFN-α tái tổ hợp (rChIFN-α) được  đánh giá hoạt tính kháng virus trong điều kiện in vitro, in ovo và in vivo; (3) Xây dựng quy trình và xác định đơn vị hoạt tính (IU/g) của rChIFN-α.

Nội dung 1, tạo chủng nấm men Pichia pastoris có khả năng biểu hiện protein ChIFN-α trên hệ thống lên men tự động dung tích 5L. Nội dung này gồm: tổng hợp gene ChIFN-α; tạo dòng plasmid pPIC9K tái tổ hợp chứa gene ChIFN-α; tạo dòng và sàng lọc các dòng nấm men Pichia pastoris mang nhiều bản sao gene ChIFN-α bằng kháng sinh G418 và biểu hiện protein trên hệ thống lên men 5L. Kết quả thu được: 5 dòng Pichia pastoris mọc trên môi trường YPD có G418 10 mg/ml. Quá trình nuôi cấy và biểu hiện, hàm lượng rChIFN-α tăng dần theo thời gian, protein thu nhận có kích thước 19 kDa, hàm lượng protein thu được 1,47g/L khi nuôi cấy trên hệ thống lên men 5L.

Nội dung 2, đánh giá khả năng kháng virus của rChIFN-α ở điều kiện in vitro, in ovo và in vivo. Ở điều kiện in vitro, xác định hiệu quả bảo vệ tế bào UMNSAH/DF1 khi bị nhiễm virus NDV của rChIFN-α. Kết quả cho thấy, khi tế bào nhiễm NDV, được xử lý với dịch rChIFN-α nồng độ 0,001 μg/ml - 0,1 μg/ml, lượng tế bào sống đạt 33,9% - 89,9%, cao hơn so với đối chứng nhiễm virus không được điều trị (26,9%). Ở điều kiện in ovo, hiệu quả kháng virus Cúm A/H5N1 thể hiện qua liều gây nhiễm 50% phôi thử nghiệm (EID₅₀). Kết quả đã xác định, virus lây nhiễm trên nhóm phôi được xử lý với rChIFN-α 100 μg/phôi có liều EID₅₀ thấp hơn nhóm đối chứng (nhiễm virus, không được xử lý với rChIFN-α) 10 lần. Ở điều kiện in vivo, xác định hiệu quả bảo vệ gà nhiễm virus Gumboro của rChIFN-α . Kết quả cho thấy, khi gà nhiễm virus, được điều trị bằng rChIFN-α 0,1 µg/con -100 µg/con, tỉ lệ bảo hộ tương ứng đạt 46,7% - 66,7%. Đồng thời khi so sánh hiệu quả rChIFN-α trong phòng bệnh và trị bệnh, nhận thấy khi phòng bệnh sử dụng rChIFN-α 10 µg/con thì tỉ lệ bảo hộ hơn 83%. Trong khi đó, sử dụng rChIFN-α để điều trị thì tỉ lệ bảo hộ đạt 53,33% - 73,33% tương ứng với liều sử dụng 10 µg/con - 100 µg/con. Tổng hợp các kết quả trên cho thấy, rChIFN-α hoàn toàn có hiệu quả kháng virus ở điều kiện in vitro, in ovo và in vivo, hiệu quả này phụ thuộc liều sử dụng.

Nội dung 3, xây dựng quy trình xác định đơn vị hoạt tính sinh học (IU/mg) của rChIFN-α. Kết quả xác định: thời gian thực hiện quy trình này cần 3-4 ngày, mật độ tế bào phù hợp khi sử dụng là 2´10⁵ tế bào/ml (2´10⁴ tế bào/giếng/100µl), virus NDV được sử dụng với liều 100 TCID₅₀/0,1ml. Đơn vị hoạt tính của các mẫu thử rChIFN-α (IU/mg) đạt 3,1 - 8,4´10⁷IU.

2. Những kết quả mới của luận án

Luận án là một công trình nghiên cứu đầu tiên xây dựng được quy trình sản xuất ChIFN-α tái tổ hợp trên hệ thống lên men 5L và xác định hiệu quả kháng virus gây bệnh trên gà (cúm, Newcastle, Gumboro), từ đó có thể ứng dụng trong phòng ngừa và khu trú các ở dịch khi có dịch bệnh xảy ra.

Luận án đã xây dựng được quy trình thường quy xác định đơn vị hoạt tính của ChIFN-α, dễ dàng thực hiện tại các phòng thí nghiệm cơ bản. Kết quả nghiên cứu này chứa thông tin tham khảo có giá trị cho các Trung tâm Kiểm nghiệm Sinh học. Hơn nữa, nghiên cứu này đặc biệt có ý tính mới vì hiện nay các cơ quan Kiểm nghiệm thuốc Thú y chưa kiểm tra được chất lượng sản phẩm interferon dùng cho Thú y đang lưu hành trên thị trường.

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

- Khả năng ứng dụng trong thực tiễn:

Xây dựng quy trình tạo ra rChIFN-α bằng cách sử dụng các kỹ thuật công nghệ để chuyển gene ChIFN-α vào genome của nấm men Pichia pastoris, có thể áp dụng vào thực tiễn sản xuất các protein tái tổ hợp khác dùng cho chăn nuôi thú y.

- Các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

Tiếp tục nghiên cứu các thành phần trong quá trình lên men có ảnh hưởng đến hiệu suất tạo protein mục tiêu và đánh giá hiệu quả của rChIFN-α khi sử dụng kèm vaccine trong phòng ngừa bệnh.

1. Thesis summary

The thesis "Research on creating interferon ChIFN-α expressing on pichia pastoris yeast cell system and testing on chicken pathogenic viruses" includes three contents: (1) creating Pichia pastoris strains had gene encoding ChIFN-α, they enable express protein on the 5L automatic fermentation system; (2) Recombinant chicken interferon alpha (rChIFN-α) was evaluated antiviral activity in vitro, in ovo and in vivo conditions; (3) Set up the procedure and determine bioactivity unit  (international unit, IU/mg) of rChIFN-α.

The first content, creating Pichia pastoris strains enable express recombinant ChIFN-α (rChIFN-α) protein on the 5L automatic fermentation system. This content include the following steps: gene synthesis ChIFN-α; cloning recombinant pPIC9K plasmid containing ChIFN-α gene; cloning and screening of Pichia pastoris strains having multiple copies of the ChIFN-α gene insert genome by antibiotic G418 and expressing protein on 5L fermentation systems. The results obtaining: collect 5 cells of Pichia pastoris growing on YPD medium which had the antibiotic G418 sulfate 10 mg/ml. During culture and expression, rChIFN-α concentration increased with expression time, the protein collected was about 19kDa and total protein concentration when culturing on the 5L automatic fermentation systems reached 1476 mg/L.

The second content, the antiviral ability of rChIFN-α was evaluated in vitro, in ovo and in vivo. In vitro condition, the determination rChIFN-α dose protected cells from viral effects. The results showed the cell infected NDV which was treated with rChIFN-α concentration of 0,001 μg/ml - 0,1 μg/ml, amount living cells reached 33,9% - 89,9%, higher than the control group - virus infected cells not treated (26,9%). In ovo conditions, the effective against Avian Influenza virus (H5N1/A) was demonstrated by median embryo infectious dose (EID50). The results showed that the virus infected embryo groups were  treated 100 μg/embryo dose having EID₅₀ 10 times lower than the control group (embryos were viral infection, without treated rChIFN-α). In vivo condition, determining effective of protection for chicks when they infected Gumboro virus. The results showed when chicks infected virus, being treated with rChIFN-α dose of 0,1 -100 µg/chick, the protection rate reached 46,7% - 66,7%, respectively.  At the same time, the survival rate of ChIFN-α group (93,3%) was also higher than the untreated control group (60%). This result proved to rChIFN-α which was effective for treating Gumboro disease and this effect being dose-dependent. At the same time, comparing effective of rChIFN-α in disease prevention and treatment, it showed Gumboro disease preventing with a 10 µg/chick rChIFN-α dose, the protection rate was over 83%. Meanwhile, chickens infected with virus and treated with rChIFN-α, the protection rate ranged from 53,33% - 73,33%, corresponding to 10 µg/chick - 100 µg/chick dose. All of results showed that rChIFN-α was completely antiviral effect in vitro, in ovo and in vivo, this effect depend on the dose.

The third content, setting up procedure for determining the bioactivity unit (international unit, IU/mg) of rChIFN-α, was based on procedure for determining the titers of Interferon alpha 2b in the Pharmacopoeia of Vietnam 5. This process consists of steps: determining suitable cell density for the test well; selecting virus strain used for this process and assessing the procedure stability through repeated many times test samples. This results showed that suitable cell density to put on plate 96 was 2´10⁵ cells/ml (2´10⁴ cells well/100µl), NDV virus was used at 100 TCID₅₀/0,1ml and the bioactive unit error was about 10% for the same sample. All of them demonstrated that rChIFN-α bioactive unit (IU/mg) procedure was stable. rChIFN-α (IU/mg) bioactive unit of samples ranged from 3,1- 8,4´10⁷ IU.

2. Novel Achievement

- The thesis was the first complete research showing rChIFN-α production process on fermentation systems, antiviral properties testing to some types of virus causing chicken diseases and recommendations to use prevention and treatment of virus diseases in experimental chickens.

- In addition, the thesis has also  given a procedure for determining the bioactivity unit (international unit, IU/mg) of rChIFN-α that it was applied regular for basic laboratory, helping research units to assess the quality substance created, promoting the process of research and production..

3. Practical applications and further research

- Practical applications:

rChIFN-α generation process was created using biotechnology techniques to transfer the ChIFN-α gene into the pichia pastoris genome, which can be applied in practice to produce other recombinant proteins for livestock veterinary.

Build process creates rChIFN-α using the technology to transfer genes ChIFN-α into the genome of Pichia pastoris, can be applied to practical production of recombinant proteins other for breeding-veterinary.

- Further research:

To further study the ingredients of fermentation process that it had affect performance of the target protein and evaluate the effectiveness of rChIFN-a when used with vaccine in disease prevention.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)