Tên đề tài: “Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric”.

Tác giả: Từ Văn Quyền, Khóa: 2014

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 62420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống.

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Đái Thị Xuân Trang - Trường Đại học Cần Thơ

1. Tóm tắt nội dung luận án

Giới thiệu: Tăng acid uric không chỉ là nguyên nhân gây ra bệnh gout, mà còn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa. Acid uric được tạo ra do enzyme xanthine oxidase (XO) xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá xanthine thành acid uric. Việc tìm ra các thảo dược và các hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng ức chế enzyme XO đồng thời không gây tác dụng phụ là vấn đề hết sức cần thiết.

Mục tiêu: (1) Ly trích được enzyme XO từ nguồn sữa bò của địa phương; (2) đánh giá được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 thảo dược; (3) ly trích được một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; (4) đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm.

Phương pháp thực hiện: Ly trích enzyme XO được thực hiện theo phương pháp kết tủa enzyme bằng ammonium sulfate. Khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết các thảo dược được khảo sát bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm khi có và không có mẫu thử. Ly trích các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược được thực hiện theo phương pháp chạy sắc ký cột hở. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đưa cao chiết vào cơ thể chuột qua đường uống, sau đó đo nồng độ acid uric trong máu chuột. Chuột được làm tăng acid uric trong máu bằng phương pháp tiêm kalioxonate vào màng bụng.

Kết quả: enzyme XO được phân lập từ sữa bò có hàm lượng protein là 0,509 mg/mg enzyme thô, enzyme sau khi được phân lập có hoạt tính và hoạt tính riêng lần lượt là 0,2095 U/mg enzyme thô và 0,412 U/mg protein. Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme XO phân lập được xác định ở pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme XO và 0,15 mM xanthine. Hiệu quả ức chế của allopurinol đối với hoạt tính của enzyme XO phân lập và enzyme thương mại là tương đương nhau. Cao ethanol nở ngày, húng chanh, dền gai ức chế enzyme XO yếu. Nồng độ ức chế 50% (IC₅₀) enzyme XO của các cao ethanol cây sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất và cỏ xước lần lượt là 222±2,65; 143±4,04; 138±1,73; 42,5±2,99 và 17,5±0,1 µg/mL. Chất đối chứng allopurinol có IC₅₀ là 9,24±0,275 µg/mL. Năm hợp chất sạch đã được cô lập từ cao ethanol cỏ xước. Trong đó, hai hợp chất không có hoạt tính ức chế enzyme XO. Ba hợp chất còn lại đã được định danh là quercetin, quercitrin và hesperetin có tác dụng ức chế enzyme XO với IC₅₀  lần lượt là 14,6; 37,7 và 103,2 µg/mL. Hợp chất quercitrin ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp. Cao ethanol cỏ xước không có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường, làm giảm đáng kể nồng độ acid uric huyết thanh chuột bệnh (186±2,1; 129,4±15,2 và 128,7±31,9 µmol/L) và làm giảm hoạt tính enzyme XO trong gan chuột tăng acid uric (2,62±0,084; 1,79±0,127 và 1,87±0,075 mM acid uric /phút/g protein) tương ứng với các liều 150; 300 và 450 mg/kg. Nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO trong gan chuột bình thường lần lượt là 127,3±38,4 µmol/L và 3,11±0,033 mM acid uric/phút/g protein. Allopurinol có tác dụng làm hạ acid uric huyết thanh trên cả chuột bình thường và trên chuột bị tăng acid uric.

Kết luận: Từ các kết quả đạt được cho thấy, cao ethanol cỏ xước có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị tăng acid uric xuống mức bình thường. Cần có định hướng sử dụng cây cỏ xước trong phòng trị tăng acid uric trong máu.

Từ khóa: acid uric, cỏ xước, quercitrin, xanthine oxidase

2. Những kết quả mới của luận án

- Đã phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò địa phương có hoạt tính tương đương với hoạt tính của enzyme thương mại. Các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO đã được xác định.

- Cao chiết của 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long đã được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO. Cao chiết ethanol cỏ xước là một đối tượng mới đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị tăng acid uric xuống đạt mức bình thường. Đề tài đã ly trích được 3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước. Trong đó, quercitrin có hoạt tính ức chế khá mạnh enzyme XO (IC₅₀ = 37,7 µg/mL).

  3. Khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

Cao ethanol cỏ xước có khả năng ứng dụng trong phòng trị tăng acid uric trong máu. Cần tiếp tục nghiên cứu tác dụng làm giảm nồng độ acid uric trong máu của các hợp chất trong cây cỏ xước, cụ thể là quercetin, quercitrin và hesperetin để có hướng sử dụng trong điều trị tăng acid uric trong máu.

1. Summary of doctoral thesis

 Introduction: The elevation of uric acid levels might be the main cause of not only gout but also cardiovascular diseases, kidney stones, diabetes and metabolic disorder. The formation of uric acid is often associated with the oxidation process catalyzed by the xanthine oxidase enzyme (XO) in which hypoxanthine can be oxidized to xanthine and then uric acid. The research and exploration of herbs and plant-related substances that perform a potential in inhibiting XO enzymes without causing any negative impacts are critical.

 Objective: (1) extract XO enzyme from local cow’s milk; (2) evaluate XO enzyme inhibitory efficiency of extracts from 8 types of herbs; (3) extract a number of substances that are able to inhibit XO enzyme from potential herbs; (4) evaluate the effects of the extracts from potential herbs on the serum-uric acid concentration of experimental mice.

Methods: The extraction of the XO enzyme was conducted followed by a method using ammonium sulfate in order to precipitate the enzyme. The inhibitory effect XO of the herbal was determined by spectroscopy at 290 nm. The mixture reaction without sample was used as a blank control. The extraction of substances functionalizing in the XO enzyme inhibition from herbs was performed using column chromatography. The investigation of impacts of extracts from potential herbs in serum-uric acid concentration was performed by giving mice extracts, and then measuring uric acid concentration in rat blood. Rats had increased uric acid in the blood by injecting potassium oxonate into the peritoneum.

 Results: XO enzyme extracted from cow’s milk contains 0.509 mg/mg of the raw enzyme. The extracted enzyme activity and specific activity were calculated to be 0.2095 U/mg and 0.412 U/mg protein, respectively. The optimal conditions for the activity of the XO enzyme were determined at pH 7.5; 0.02 U/mL enzyme and 0.15 mM xanthine. The inhibitory efficiency of allopurinol versus the activity of the extracted XO enzyme and the commercial enzyme was approximate. The ethanol extracts of Gomphrena globosa, Plectranthus amboinicus, Amaranthus spinosus showed low efficiency in the inhibition of XO enzyme. The half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) XO enzyme of ethanol extracts in terms of Mesona chinensis, Orthosiphon stamineus, Elsholtzia ciliate, Gomphrena celosiodes and Achyranthes aspera” were 222±2.65; 143±4.04; 138±1.73; 42.5±2.99 và 17.5 µg/mL, respectively. The positive control allopurinol has the IC₅₀ value of 9.24 µg/mL. Five compounds from ethanol extract of Achyranthes aspera were isolated. Among them, two compounds did not exhibit an XO enzyme inhibitory activity. Three other compounds have been identified as quercetin, quercitrin and hesperetin indicated an effective activity in XO enzyme inhibition in which IC₅₀ values are 14.6; 37.7 and 103.2 µg/mL, respectively. Quercitrin compound inhibited XO enzyme according to mixed type. Achyranthes aspera ethanol-extract did not cause a change in serum-uric acid concentration in normal mouse but significantly reduced the serum-uric acid concentration in  mouse model for hyperuricemia (186±2.1; 129.4±15.2 và 128.7±31.9 µmol/L) and XO enzyme activity in increased-uric acid mouse liver corresponding to 150; 300 and 450 mg/kg treatments. The uric acid concentration in blood and XO enzyme activity in normal mouse liver were 127.3±38.4 µmol/L and 3.11±0.033 mM acid uric /min/g protein, respectively. The result illustrated that allopurinol had an effect on releasing serum-uric acid level in terms of either normal mouse or increased-uric acid mouse.

In conclusion, Achyranthes aspera ethanol extracts efficiently induced an inhibition on the XO enzyme and reduced the serum-uric acid concentration in increased-uric acid mice to a normal threshold. The use of Achyranthes aspera in preventing increased uric acid levels in the blood should be further investigated.

Keywords: Achyranthes aspera, uric acid, quercitrin, xanthine oxidase

2. Innovative contribution of the thesis

- Successfully collected XO enzyme from cow’s milk which possessed activities similar to the commercial enzyme. The optimal condition for XO enzyme activities has been determined.

- Ethanol crude extract of 8 kinds of herbs collected from Mekong Delta has been examined the XO enzyme inhibition. Ethanol crude extract from Achyranthes aspera showed the strongest effect to the XO enzyme inhibition and decrase the uric acid concentration in serum to a normal level. This study successfully extracted 3 XO enzyme inhibitor compounds from Achyranthes aspera and quercitrin owned strong XO enzyme inhibition (IC₅₀ = 37,7 µg/mL). 

3. Practical applicability, issues that need further research:

Achyranthes aspera ethanol extract has potential applications in the treatment of hyperuricemia in the blood. Research on the reduction of uric acid in blood using compounds in Achyranthes aspera, namely quercetin, quercitrin and hesperetin to prevent uric acid should be continuously investigated.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)