Tên đề tài: “Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae”.

Tác giả: Đoàn Thị Kiều Tiên, Khóa: 2015

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật; Mã số: 62620110. Nhóm ngành: Nông, lâm nghiệp và thuỷ sản.

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Nga - Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy - Hội Bệnh hại Thực vật Việt Nam

1. Tóm tắt nội dung luận án

Luận án được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm Bệnh cây và nhà lưới thuộc Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, vùng trồng lúa tại tỉnh Vĩnh Long và Viện Kỹ Thuật Kyoto Nhật Bản từ 2015 đến 2019. Luận án “Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae” nhằm tuyển chọn những dòng thực khuẩn thể triển vọng có hiệu quả trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn B. glumae ở điều kiện ngoài đồng, từ đó khẳng định hiệu quả của biện pháp sinh học sử dụng thực khuẩn thể trong quản lý bệnh thối hạt lúa, góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong môi trường. Luận án được hoàn thành với các nội dung chính như sau:

Nội dung một là phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa. Phân lập được 112 dòng thực khuẩn thể và 60 dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa tại chín tỉnh đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam. Đã chọn được 8 dòng thực khuẩn thể (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) có phổ kí sinh rộng trên nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt (chiếm khoảng 75% trong tổng số vi khuẩn gây bệnh thối hạt), đồng thời cũng chọn 6 dòng vi khuẩn (BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) gây bệnh thối hạt bị nhiều dòng thực khuẩn thể kí sinh (chiếm 55% dòng thực khuẩn thể kí sinh). Tiếp theo, xác định được 6 dòng vi khuẩn (BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) gây bệnh thối hạt lúa bằng kỹ thuật sinh học phân tử với cặp mồi đặc hiệu 1416S/1414A là loài Burkholderia glumae. Qua đánh giá khả năng gây hại bệnh thối hạt lúa của 6 dòng vi khuẩn B. glumae (BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) đã tìm ra dòng vi khuẩn BurDT46 được phân lập tại Đồng Tháp gây bệnh thối hạt cao hơn các dòng vi khuẩn còn lại. So sánh khả năng phân giải của 8 dòng thực khuẩn thể (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) trên vi khuẩn BurDT46 đã xác định được bốn dòng thực khuẩn thể (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a và ФBurDT48a) cho đường kính phân giải cao hơn các dòng thực khuẩn thể còn lại.

Nội dung hai là đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt do vi khuẩn B. glumae của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới. Đầu tiên, khảo sát khả năng phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn B. glumae DT46 của bốn dòng thực khuẩn thể triển vọng (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a và ФBurDT48a) với việc xử lý từng dòng đơn lẽ hay hỗn hợp 4 dòng ở mật số 10⁸ pfu/ml, kết quả cả bốn nghiệm thức xử lý TKT đơn hay HH TKT đều cho hiệu quả giảm bệnh thối hạt khác biệt với nghiệm thức đối chứng. Trong đó dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 cho hiệu quả giảm bệnh trên 70% cao hơn các nghiệm thức còn lại. Thứ hai, so sánh hiệu quả của dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 ở bốn mật số khác nhau (10⁵ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml và 10⁸pfu/ml) trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn B. glumae, kết quả cả bốn mật số thực khuẩn thể đều có tỷ lệ hạt nhiễm bệnh thấp hơn và khác biệt với nghiệm thức đối chứng, đặc biệt mật số 10⁸pfu/ml thể hiện hiệu quả phòng trị bệnh tốt nhất với tỷ lệ hạt bệnh thấp hơn và khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Hơn nữa, xác định được 2 thời điểm áp dụng thực khuẩn thể gồm phun thực khuẩn thể 2 giờ trước khi lây bệnh, hay phun thực khuẩn thể kết hợp 2 giờ trước khi lây bệnh và 5 ngày sau khi lây bệnh cho hiệu quả phòng trị bệnh cao hơn và khác biệt phun thực khuẩn thể 5 ngày sau khi lây bệnh.

Nội dung thứ ba là nghiên cứu định danh các dòng thực khuẩn thể triển vọng nhằm xác định tính an toàn của TKT khi áp dụng trong thực tế sản xuất. Về mặt hình thái cả ba dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đều thuộc họ Podoviridae với đặc điểm đầu là khối đa diện và đuôi ngắn. Về kết quả giải trình tự bộ genome của ba thực khuẩn thể ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a với kích thước bộ gen tuần tự là 44.657 bp, 36.275bp và 45.466 bp, đều có % G+C là 58%, đặc biệt cả ba thực khuẩn thể này đều thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phage hay lytic phages) do bộ gen không có gen qui định enzyme integrase chỉ thể hiện ở thực khuẩn thể ôn hòa.

Nội dung thứ tư là đánh giá hiệu quả của các dòng thực khuẩn thể triển vọng phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng. Đầu tiên, khảo sát hiệu quả của việc xử lý thực khuẩn thể ФBurAG58 đơn và hỗn hợp 3 dòng TKT (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a) ở mật số 10⁸ pfu/ml với hai lần phun trước và sau khi trổ ở vụ Đông Xuân 2017-2018, kết quả đã ghi nhận nghiệm thức xử lý TKT ФBurAG58 đơn hay hỗn hợp thực khuẩn thể giảm bệnh thối hạt tương đương với nghiệm thức xử lý oxolinic axit và khác biệt nghiệm thức đối chứng với hiệu quả giảm bệnh khoảng 50%, góp phần bảo vệ tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa. Thứ hai, khảo sát hiệu quả của nghiệm thức xử lý thực khuẩn thể ФBurAG58 đơn và HH TKT (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a) ở hai mật số 10⁷ pfu/ml và 10⁸ pfu/ml, kết quả ФBurAG58 (10⁸pfu/ml) và hỗn hợp thực khuẩn thể (10⁸pfu/ml) cho hiệu quả giảm bệnh thối hạt lúa cũng tương đương với nghiệm thức oxolinic axit với hiệu quả giảm bệnh khoảng 50%.

Nội dung thứ năm là khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể ФBurAG58 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả ghi nhận môi trường King’s B lỏng, Nutrient lỏng, PDA + Peptone lỏng cho mật số thực khuẩn thể cao hơn và khác biệt với môi trường PDA lỏng. Tiếp tục khảo sát thời gian cấy vi khuẩn kí chủ trước hay cùng lúc với thời gian cấy TKT lên khả năng nhân nuôi thực khuẩn thể ФBurAG58 trên hai dạng môi trường King’s B (King’s B lỏng và King’B 0,8% agar). Kết quả thực khuẩn thể ФBurAG58 cho mật số cao trong môi trường King’s B lỏng ở điều kiện cấy vi khuẩn B. glumae trước 16 giờ sau đó bổ sung thực khuẩn thể. Ngoài ra, tìm ra chỉ số MOI là 1,0 cho log mật số thực khuẩn thể đạt giá trị 10,00 (tương ứng 10¹⁰ pfu/ml) cao hơn chỉ số MOI 0,01 và MOI 0,1. Cuối cùng, nhiệt độ 30⁰C cho log mật số thực khuẩn thể cao hơn và khác biệt với hai nhiệt độ 27⁰C và 37⁰C vào thời điểm 24 giờ sau khi nhân nuôi.

2. Những kết quả mới của luận án

• Xác định vi khuẩn gây bệnh thối hạt chủ yếu trên lúa ở ĐBSCL là do loài Burkholderia glumae
• Xác định được ba dòng thực khuẩn thể có tiềm năng cao trong phòng trị bệnh thối hạt ở điều kiện ngoài đồng với hiệu quả giảm bệnh trên 50% tương đương thuốc hóa học. Ba dòng thực khuẩn thể này được xác định thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phages) nên đạt tính an toàn trong quản lý bệnh thối hạt do vi khuẩn B.
• Xác định được điều kiện nhân nuôi tối hảo của dòng thực khuẩn thể triển vọng đạt được mật số cao tương đương 10¹⁰ pfu/ml, có thể đáp ứng được yêu cầu sử dụng trên diện rộng.

3. Khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

- Khả năng ứng dụng trong thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần mở ra chiến lược quản lý bệnh do vi khuẩn theo hướng thân thiện với môi trường, đặc biệt bệnh thối hạt lúa tại Việt Nam. Đồng thời kết quả cũng thấy khả năng ứng dụng thực khuẩn thể mang tính khả thi dựa vào hiệu quả giảm bệnh và phương pháp nhân nuôi.

- Các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

• Tiếp tục nghiên cứu khảo nghiệm hiệu quả của hỗn hợp thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh thối hạt trên diện tích rộng ở nhiều tỉnh ĐBSCL
• Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện tồn trữ chế phẩm thực khuẩn thể dài hạn ở nhiệt độ phòng góp phần đưa ứng dụng thực khuẩn thể tiếp cận thực tiễn.

Thesis title: “Study on using bacteriophages in controlling rice grain rot disease caused by Burkholderia glumae.”

Speciality: Plant Protection                          

Speciality ID: 62 62 01 12

PhD student: Doan Thi Kieu Tien.

Principal supervisor: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Thi Thu Nga.

Co-supervisor: Assoc. Prof. Dr. Tran Thi Thu Thuy

Academic institute: CanTho University.

1. Thesis summary

The thesis was conducted under the plant pathology laboratory and greenhouse conditions of the Plant Protection Department, College of Agriculture, Can Tho University, the location of Vinh Long Province and Kyoto Institute of Technology from 2015 to 2019. The thesis “Study on using bacteriophages in controlling rice grain rot disease caused by Burkholderia glumae” aimed to select promising bacteriophage strains that are effective in the prevention of rice grain rot caused by B. glumae in the field, thereby confirming the effectiveness of biological control used by bacteriophages in the management of rice grain rot, contributes to reduce the amount of chemicals in the environment. The thesis is completed with the following main contents:

The first content was to isolate, screen the bacteriophages and bacteria that cause rice grain rot.  There were to isolate 112 bacteriophages and 60 bacterial strains causing grain rot were isolated from nine provinces in the Mekong Delta of Vietnam. Collected eight bacteriophages (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) were selected based on their wide parasitic spectrum on many bacterial strains causing grain rot (about 75% of total bacteria causing grain rot disease), and also selected six bacterial strains causing grain rot (i. e. BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) were lysed by bacteriophage (about 55% in a total 112 bacteriophages). Determination of the bacterial causal agent of rice grain rot was Burkholderia glumae by using PCR technique with specific primers 1416S/1414A. Evaluating pathogenicity of six B. glumae strains (i. e. BurVL21, BurDT46, BurDT50, BurDT51, BurKG52 and BurKG57) on rice, the result was that BurDT46 isolated in Dong Thap caused high grain rot disease than the remaining bacterial strains. Comparison of the lytic ability of these 8 bacteriophages to B. glumae DT46 showed that 4 bacteriophages as ФBurDT47a, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurAG58 lysed this bacterium higher others.

The second content was to evaluate of the control ability of rice grain rot caused by B. glumae of four promising bacteriophages (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a, ФBurDT48a) in the greenhouse conditions. Firstly, examination of the control ability of bacteriophages to prevent bacterial grain rot caused by B. glumae DT46 with the treatment of individual phages or a four- phages mixture at titer 10⁸ pfu/ml, results in all four single or mixed bacteriophages treatments that effectively reduce grain rot disease compared to the control treatment. In which, bacteriophage ФBurAG58 gave a disease reduction efficiency of over 70% which was higher than other treatments. Secondly, comparing four different titers of ФBurAG58 (10⁵ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁸pfu/ml) for controlling of rice bacterial grain rot caused by B. glumae, the result showed that all treatments gave lower the percentage of infected grains than the control, especially the titer of 10⁸ pfu/ml gave lower percentage of infected grains than the other treatments. Furthermore, determined phage application including spraying bacteriophages at 2 hours before pathogen inoculation or combined spraying phage at 2 hours before pathogen inoculation and 5 days after pathogen inoculation expressed higher percentage of infected grains than the spraying bacteriophage at 5 days after pathogen inoculation.

The third content was the study of the identification of promising bacteriophages to determine the safety when applied in production practice. Morphology of three promising bacteriophage (i. e. ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) under a transmitted electron microscope (TEM) belong to the family Podoviridae with icosahedral head and short tail. On the results of genome sequencing of the three phages ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a with a sequencing genome size of 44,657 bp, 36,275bp and 45,466 bp, all have a G+C% of 58%.  Especially all of three bacteriophages belonged to virulent phage (or lytic phage) based on their genome do not consist gene encoding for integrase enzyme which only expressed on temperate phages.

The four content was to evaluate the effect of promising bacteriophages to control bacterial grain rot of rice in the field conditions. The first field trial was investigated the disease control efficiency of application as ФBurAG58 single or phage cocktail (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a) at the density of 10⁸ pfu/ml with two sprays before and after flowering stage in  Winter – Spring crop (2017 – 2018), the results showed that ФBurAG58 single and  phage cocktail were equaled to the oxolinic acid and significantly lower percentage of infected grains, compared to the control, with disease reduction about 50%, and contributing to protect the percentage of filled grains and yield. The second field trial, examinated the disease control efficiency of application as ФBurAG58 single or phage cocktail (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a) at two titers 10⁷ pfu/ml and 10⁸ pfu/ml in Early Summer-Autumn crop (2018), the results showed that ФBurAG58 (10⁸pfu/ ml) and phage cocktail (10⁸pfu/ml) expressed equal disease control ability to the oxolinic acid with control efficacy of bacterial grain rot disease about 50%.

The five content was study on the culture conditions of phage ФBurAG58 in in vitro. Firstly, investigation of four kinds of medium in culturing phage, result showed that three media i.e. King's B broth, Nutrient broth and PDA + Peptone broth gave higher phage titer than PDA broth. Next, survey the time of culturing host bacteria before or at the same time as the time of culturing phage in multiplying phage ФBurAG58 on two types of King's B medium (King's B liquid and King'B 0.8% agar). Phage ФBurAG58 gave high density in a liquid King's B medium under the condition of culturing B. glumae bacteria 16 hours before adding bacteriophages. In addition, result found that MOI of 1.0 for the log of phage population reached a value of 10.00 (corresponding to 10¹⁰ pfu/ml) which was higher than the MOI of 0.01 and the MOI of 0.1. Lastly, investigation of temperature 30⁰C gave higher log of bacteriophage titer and was significant different from two temperatures of 27⁰C and 37⁰C at 24 hours after inoculation.

2. The novelty of the thesis

 Firstly, it was determined that the bacteria causing the major grain rot disease in rice in the Mekong Delta was caused by the species Burkholderia glumae. Secondly, three bacteriophages have been identified with high potential in the treatment of bacterial grain rot in field conditions with disease reduction efficiency of over 50% equivalent to chemical compound. These three bacteriophages were identified as virulent phages, so they are safe in the management of bacterial grain rot caused by B. glumae. Finally, the optimal culture conditions of the promising bacteriophage line were determined with a density as high as 10¹⁰ pfu/ml, which could apply the requirements of large-scale use.

3. Application prospect and suggestions for further study

- Application prospect

The research results will contribute to opening up an environment-friendly management strategy for bacterial diseases, especially rice grain rot in Vietnam. At the same time, the results also show that the application of bacteriophages is feasible based on the disease reduction efficiency and the culture method.

- Suggestions for further study

- Continue to study and test the effectiveness of bacteriophage mixture in preventing seed rot disease on a large area in many provinces in the Mekong Delta.- It is necessary to continue to study the conditions of long-term storage of phage preparations at room temperature to contribute to the practical approach of phage application.

• Xem chi tiết nội dung luận án
•  Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)