Tên đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ các sản phẩm đậu nành lên men có khả năng sinh protease và thủy phân fibrin”

Tác giả: Lê Thị Ngọc Hân, Khóa: 2016

Ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 62420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống

Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Văn Thành - Trường Đại học Cần Thơ

1. Tóm tắt nội dung luận án

Đề tài này được thực hiện với mục đích phân lập và tuyển chọn được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease và fibrinolytic enzyme có hoạt tính đặc hiệu cao từ sản phẩm đậu nành lên men, nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu dòng vi khuẩn được chọn sinh fibrinolytic enzyme hoạt tính cao, khảo sát các phương pháp thu nhận fibrinolytic enzyme thô phù hợp và nghiên cứu đặc điểm fibrinolytic enzyme sau tinh sạch. Kết quả phân lập được 115 dòng vi khuẩn từ các sản phẩm đậu nành lên men: chao, nước mắm chay, nước tương, tương hột ở các địa phương An Giang (24 dòng), Bến Tre (14 dòng), Cần Thơ (26 dòng), Đồng Tháp (12 dòng), Hậu Giang (14 dòng), Sóc Trăng (13 dòng), Vĩnh Long (12 dòng). Kết quả định danh sơ bộ dựa vào đặc điểm hình thái (tế bào và khuẩn lạc) và sinh hóa (nhuộm Gram, khả năng sinh bào tử, khả năng sinh catalase và kiểm tra methyl red) cho thấy các dòng này thuộc chi Bacillus. Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng phân giải protein trên môi trường SMA, kết quả kiểm tra khả năng sinh protease trên đĩa SMA đã tuyển chọn được 15 dòng có đường kính vòng halo lớn (từ 2,17-2,55 cm). Trong môi trường lên men lỏng với mật số 1,0x10⁶ tế bào/mL; pH 7,2 ở 37 ^oC trong 48 giờ, chọn được dòng ML01 cho hoạt tính protease đặc hiệu cao 185,92 U/mg và hoạt tính fibrinolytic enzyme đặc hiệu cao nhất 92,23 FU/mg. Kết quả định danh theo phương pháp giải trình tự, trình tự dòng ML01 được giải gồm 1398 bps, cho thấy trình tự 16S rRNA của dòng ML01 có độ tương đồng 99,86 % so với trình tự gen 16S rRNA của Bacillus subtilis subsp. spizizenii (số đăng kí trên genbank là NR_112686.1). Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy Bacilus subtilis ML01 nhằm thu nhận fibrinolytic enzyme có hoạt tính cao. Thiết kế thí nghiệm Plackett- Burman được sử dụng để sàng lọc các yếu tố tối ưu nhất cho tổng hợp fibrinolytic enzyme. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ, carbon và khoáng được tuyển chọn làm các thành phần môi trường tối ưu. Trong đó, mười yếu tố bao gồm glucose, maltose, sucrose, soya peptone, yeast extract, K₂HPO₄ , MgSO₄, CaCl₂, pH và mật số tế bào được chọn để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính trong môi trường lên men. Trong các yếu tố khảo sát, maltose, soya peptone, K₂HPO₄, mật số tế bào là 4 yếu tố tác động nhiều nhất (p<0,05). Các yếu tố này được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) phương án cấu trúc có tâm (CCD). Kết quả nhận được môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp fibrinolytic enzyme gồm glucose 18,15 g/L, soya peptone 9,59 g/L, K₂HPO₄ 2,33 g/L và mật số vi khuẩn 2,6x10⁶ tb/mL. Sau 48 giờ lên men cho hoạt tính fibrinolytic enzyme cao nhất 25,56 FU/mL cao hơn trước khi tối ưu 2,9 lần (8,89 FU/mL). Khảo sát các khoảng thời gian lên men, kết quả cho thấy dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ML01 sinh tổng hợp fibrinolytic enzyme cho hoạt tính cao nhất là sau 48 giờ lên men. Tinh sạch sơ bộ enzyme từ dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ML01 với ammonium sulfate (AS) ở nồng độ 80% bão hòa cho kết quả cao nhất so với các nồng độ nghiên cứu khác, trung bình tổng hoạt tính fibrinolytic enzyme (FE) là 72,22 U/mL và trung bình tổng hoạt tính đặc hiệu là 121,6 U/mg. Sau các công đoạn tinh sạch sắc ký trao đổi ion DEAE -cellulose và sắc ký lọc gel, kết quả cho thấy độ tăng hoạt tính tăng dần theo từng ph

Thesis title: Isolation and selection of Bacillus spp. from fermented soybean products for protease and fibrinolytic enzyme production

- Major: Biotechnology                                                Code: 62420201

- Full name of PhD student: Le Thi Ngoc Han           Year: 2016 - 2020

- Scientific supervisor: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Van Thanh

- Educational institution: Cantho University

1. Content of thesis summary

This thesis aimed to isolate and select strains of Bacillus for protease and fibrinolytic enzyme production from fermented soybean products. Research on optimal culture conditions for selected bacterial strain that produce highly activity fibrinolytic enzymes, investigate appropriate methods of obtaining crude fibrinolytic enzymes, and study the characteristics of fibrinolytic enzymes after purification. The results showed that 115 bacterial strains were isolated from fermented soybean products, including soy sauce, fermented tofu, vegan fish sauce in the localities of An Giang (24 strains), Ben Tre (14 strains), Can Tho (26 strains), Dong Thap (12 strains), Hau Giang (14 strains), Soc Trang (13 strains), and Vinh Long (12 strains). Based on the major classification keys of bacteria, including morphological (cells and colonies) and biochemical characteristics (gram staining, spore production, catalase production and methyl red testing), these isolated bacteria were characterized as belong to Bacillus genus. All bacterial strains could resolve on SMA medium, and the results of protease generation test showed that 15 selected strains could form halo circle with the highest diameter (2.17-2.55 cm). The ability to produce protease in SmF of the 15 selected strains was investigated, the results showed that ML01 strain in SmF with 1×10⁶ cells/mL, pH 7.2 incubated at 37 °C for 48 hours exhibited the highest specific protease activity of 185.92 U/mg and specific fibrinolytic enzyme activity 92.23 FU/mg. Sequence analysis results of 16SrRNA gene region of ML01 showed a high relationship (99.86%) with the sequence of Bacillus subtilis subsp. spizizenii (registration number on genbank is NR_112686.1)

The optimal medium for fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtillis ML01 was employed. The effects of nitrogen, carbon, and inorganic salt sources were investigated to select the optimal combination of medium components. Plackett-Burman design subsequently analyzed these factors to determine the optimal factors for fibrinolytic enzyme production. Ten factors including glucose, maltose, sucrose, soya peptone, yeast extract, K₂HPO₄, MgSO₄, CaCl₂, pH and bacterial density were screened the best factors for the fermentation and production of fibrinolytic enzyme. Among the factors surveyed, four factors, namely maltose, soya peptone, K₂HPO₄ and bacterial density, showed significantly effect (p<0.05). These four factors were subsequently optimized by using the response surface methodology (RSM) with the central composite design (CCD). The results indicated that the optimal medium for the production of fibrinolytic enzyme consisted of the following components maltose (18.15 g/L), soya peptone (9.59 g/L), K₂HPO₄ (2.33 g/L), and the bacterial density 2.6×10⁶ cells/mL. Under these conditions, the fibrinolytic enzyme reached its highest activity at 25.56 FU/mL, which was 2.9 times higher than the activity observed in the pre-optimized medium (8.89 FU/mL). The results also demonstrated that the Bacillus subtilis ML01 strain biosynthesized fibrinolytic enzyme with the highest activity after 48 hours of fermentation.

The preliminary purification of the enzyme from Bacillus subtilis ML01 with ammonium sulfate (AS) at 80% saturation gave the highest results compared with other studied concentrations. The average total fibrinolytic enzyme activity (FE) was 72.22 U/mL and the mean total specificity was 121.6 U/mg. Following the purification stages of DEAE-cellulose ion exchange chromatography and gel filtration chromatography, the results indicated a gradual increase in activity with each fraction. After G75 gel filtration chromatography, the activity of fibrinolytic enzyme increased by 4.1 times compared to the original crude enzyme sample.

In the enzyme characterization study, the fibrinolytic enzyme obtained from Bacillus subtilis ML01 exhibited the highest fibrinolytic activity at pH 8. The activity stability of enzyme after purification also increased with increasing pH value, remaining relatively stable within the pH range of 7 to 9. When the temperature was increased from 30 to 37^oC, the relative activity increased and reaching its peak at 37^oC (100%) and then decreased, the enzyme nearly lost all of its activity at 70^oC. Regarding the influence of metal ions and inhibitors on the activity of different enzymes, Cu²⁺ and Fe²⁺ ions increased enzyme activity at both 1mM and 5mM concentrations; PMSF inhibitors had the most significant effect, leading to complete loss of enzyme activity at both concentrations, SDS also adversely affected enzyme activity, while EDTA had a lower effect.

2. The novel aspects from the thesis

This is the first study on Bacillus spp. strains isolated from fermented soybean products in the Mekong Delta region with the ability to produce protease and fibrinolytic enzymes for blood clot dissolution. The results of the isolation yielded 115 strains of Bacillus spp. with the ability to produce protease enzymes, among which the strain ML01 was selected for its high fibrinolytic enzyme activity in blood clot dissolution. Strain ML01 showed a 99.86% similarity to the 16S rRNA gene sequence of Bacillus subtilis subsp. spizizenii (GenBank accession number NR_112686.1). The environmental culture conditions for cultivating strain ML01 were optimized to obtain fibrinolytic enzymes with high activity. The fibrinolytic enzyme from strain ML01 was purified and characterized. The research results provide a scientific foundation for further studies on the production and application of protease enzymes from isolated bacterial strains, especially fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis ML01, for blood clot dissolution in the prevention and treatment of cardiovascular diseases.

3. Application prospect and suggestions for further study

Proteases are one of the most important groups of industrial enzymes with many applications in the food, pharmaceutical, and waste treatment industries. Fibrinolytic enzyme (thrombolytic enzyme) belongs to the protease group that can prevent and treat cardiovascular disease and stroke caused by thrombosis. Fibrinolytic enzymes are obtained from many sources, but mainly from Bacillus spp. isolated from fermented soybean products, a cheap, safe and effective source of raw materials. The research results supplement scientific data on Bacillus spp. and the ability to produce protease and fibrinolytic enzymes. This is a new research direction using indigenous bacterial strains for research on protease and fibrinolytic enzymes, which is a premise for future applied research.

ân đoạn và sau sắc ký lọc gel G75 thì độ tăng hoạt tính của fibrinolytic enzyme gấp 4,1 lần so với mẫu enzyme thô ban đầu. Kết quả khảo sát đặc tính enzyme, thu nhận được fibrinolytic enzyme từ Bacillus subtilis ML01 thể hiện hoạt tính tiêu sợi huyết cao nhất ở pH 8. Độ bền hoạt tính của enzyme sau tinh sạch cũng tăng dần theo giá trị pH tăng, hoạt tính tương đối ổn định trong khoảng từ pH 7 đến 9. Khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 37^oC hoạt tính tương đối cho giá trị tăng lên và đạt cực đại ở 37^oC (100%) sau đó hoạt tính enzyme giảm dần ở các mức nhiệt độ tăng dần, enzyme gần như đã mất hoàn toàn hoạt tính ở 70^oC. Ảnh hưởng các ion kim loại và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme khác nhau, ion Cu²⁺ và Fe²⁺ làm tăng hoạt tính của enzyme ở cả 2 mức nồng độ 1mM và 5mM; chất ức chế PMSF ảnh hưởng mạnh nhất gây mất hoạt tính enzyme hoàn toàn ở cả 2 nồng độ, SDS cũng ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzyme, trong khi đó EDTA ảnh hưởng thấp hơn.

2. Những kết quả mới của luận án

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về các dòng vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ các sản phẩm đậu nành lên men ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long có khả năng sản sinh enzyme protease và fibrinolytic enzyme làm tan huyết khối. Kết quả phân lập được 115 dòng vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng sinh enzyme protease, trong đó tuyển chọn được dòng vi khuẩn ML01 có khả năng sinh fibrinolytic enzyme phân giải huyết khối cao (hoạt tính đặc hiệu cao). Dòng vi khuẩn ML01 có độ tương đồng 99,86% so với trình tự gen 16S rRNA của Bacillus subtilis subsp. spizizenii (số đăng kí trên genbank là NR_112686.1). Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi cấy dòng vi khuẩn ML01 để thu fibrinolytic enzyme có hoạt tính cao. Tinh sạch và khảo sát được đặc điểm của fibrinolytic enzyme từ dòng vi khuẩn ML01. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về sản xuất và ứng dụng enzyme protease từ các dòng vi khuẩn phân lập, đặc biệt fibrinolytic enzyme từ vi khuẩn Bacillus subtilis ML01 để làm tan huyết khối trong phòng và điều trị bệnh tim mạch.

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

Nhóm enzyme protease là nhóm có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, xử lý chất thải. Fibrinolytic enzyme (enzyme phân hủy huyết khối) thuộc nhóm protease có khả năng phòng ngừa và điều trị bệnh tim mạch, đột quỵ do huyết khối gây ra. Fibrinolytic enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn, nhưng chủ yếu từ vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ các sản phẩm đậu nành lên men, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, an toàn và hiệu quả. Kết quả nghiên cứu bổ sung thêm dẫn liệu khoa học về vi khuẩn Bacillus spp. và khả năng sinh protease và fibrinolytic enzyme. Đây là hướng nghiên cứu mới sử dụng dòng vi khuẩn bản địa cho các nghiên cứu về protease và fibrinolytic enzyme, là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng sau này.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)