Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio spp. từ các vùng nuôi tôm

Tác giả: Lê Hoàng Bảo Ngọc, Khóa: 2019

Ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 9420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trương Thị Bích Vân - Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Lê Việt Dũng - Trường Đại học Cần Thơ

1. Tóm tắt nội dung luận án

Vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở một số đối tượng nuôi thủy sản. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh đã cho thấy những tác động tiêu cực như vi khuẩn đề kháng kháng sinh, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm. Vì vậy, luận án “Phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio spp. phân lập từ các vùng nuôi tôm” được thực hiện làm tiền đề cho nghiên cứu về phương pháp thay thế kháng sinh trong phòng trừ bệnh do vi khuẩn gây ra góp phần hạn chế sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm hướng đến một nền nông nghiệp xanh, phát triển bền vững và bảo vệ môi trường. Để đảm bảo mục tiêu trên, luận án được triển khai với ba nội dung chính, trong đó nội dung thứ nhất được bố trí với 02 thí nghiệm: Phân lập vi khuẩn Vibrio spp. và hệ thực khuẩn thể (TKT) có trong mẫu tôm và ao nuôi tôm ở các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang; đánh giá phổ ký chủ và hiệu quả ức chế vi khuẩn của các chủng TKT trong điều kiện phòng thí nghiệm; nội dung thứ hai: Khảo sát khả năng điều trị bệnh của TKT trong mô hình nuôi tôm trong bể nhỏ; nội dung thứ ba: Nghiên cứu đặc điểm di truyền của TKT thông qua Giải trình tự và công bố bộ gen của ít nhất 1 chủng TKT có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio spp. Bằng cách sử dụng các phương pháp chuyên biệt cho nghiên cứu TKT như khảo sát vết tan 2 lớp agar, nhỏ giọt 2 lớp agar, phần mềm phân tích tin sinh học BLASTN, BLASTX, và BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast);GeneMark(http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/genemarks.cgi); tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAsc); CGView (https://proksee.ca/), luận án đã đạt kết quả như: phân lập được 16 chủng Vibrio spp. trong đó có 9 chủng Vibrio parahaemolyticus, 2 chủng Vibrio alginolyticus, đặc biệt phân lập được 33 chủng TKT có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Vibrio spp., chọn được 3 chủng TKT (29k-A23, ST5386 và ST22) có phổ ký chủ rộng, khả năng xâm nhiễm tốt vi khuẩn Vibrio spp. Ở điều kiện in vivo, bằng cách theo dõi các chỉ tiêu tỉ lệ sống của tôm, dấu hiệu bệnh và mô học, cho thấy TKT 29k-A23 thể hiện được khả năng trong việc kiểm soát bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Từ kết quả trên TKT 29k-A23 đã được giải trình tự cho thấy bộ gen của TKT 29k-A23 dài 29115 kp, dạng vòng với tỉ lệ G+C là 53.5%, mã hóa 40 ORF, trong đó không có gen tRNAs nào được nhận diện trong bộ gen của TKT. Bản đồ gen cho thấy các gen mã hoá cho các protein cấu trúc của TKT có đầy đủ thành phần cơ bản của một TKT có đuôi, DNA sợi đôi, thuộc bộ Caudovirales trong đó có ORF 9 mã hoá cho sheath tail, phần vỏ bao đuôi đặc trưng cho nhóm TKT thuộc họ Peduoviridae. Bên cạnh đó đề tài cũng đã tiến hành giải trình tự của 2 chủng TKT ST5386 và ST22 (đã được đăng ký trên ngân hàng gen với mã số truy cập lần lượt là PP41774.1 và OQ957557.1), kết quả cho thấy sự đa dạng của các TKT trong tự nhiên, cả 3 đều thuộc 3 nhóm TKT khác nhau.

2. Những kết quả mới của luận án

Luận án là nghiên cứu đầu tiên được thực hiện về nghiên cứu ứng dụng TKT trong ức chế vi khuẩn Vibrio spp. trên tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long, kết quả đạt được những điểm mới cụ thể sau đây:

- Phân lập được 3 chủng TKT (29k-A23, ST5386 và ST22) có phổ ký chủ rộng, khả năng xâm nhiễm tốt vi khuẩn Vibrio spp.

- Thực hiện thí nghiệm trên mô hình tôm, đã xác định được TKT 29k-A23 có khả năng kiểm soát bệnh do vi khuẩn V. parahaemoluticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

- Kết quả giải trình tự bộ gen TKT 29k-A23 cho thấy bộ gen của TKT 29k-A23 dài 29115 kp, dạng vòng với tỉ lệ G+C là 53.5%, mã hóa 40 ORF, trong đó không có gen tRNAs nào được nhận diện trong bộ gen của TKT. Các protein cấu trúc đặc trưng cho thấy 29k-A23 là  một TKT có đuôi, DNA sợi đôi, thuộc bộ Caudovirales trong đó có ORF 9 mã hoá cho sheath tail, phần vỏ bao đuôi đặc trưng cho nhóm TKT thuộc họ Peduoviridae

 - Bộ gen của TKT ST5386 và ST22 cũng đã được tiến hành giải trình tự và đăng ký trên ngân hàng gen với mã số truy cập lần lượt là PP41774.1 và OQ957557.1

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

Khả năng ứng dụng

Vibrio spp. là nguyên nhân gây bệnh nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản. Tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh và việc tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản đã dẫn đến yêu cầu cấp thiết về nghiên cứu chế phẩm thay thế kháng sinh. TKT là một loại virus có khả năng ký sinh và tiêu diệt vi khuẩn, tồn tại phong phú trong môi trường tự nhiên, nên được coi là một giải pháp sinh học an toàn thay thế tiềm năng cho kháng sinh. Do đó kết quả nghiên cứu của luận án sẽ góp phần vào những nghiên cứu thực tiễn, ứng dụng TKT trong quá trình nuôi tôm, hạn chế sử dụng kháng sinh, hướng đến nền nông nghiệp an toàn, phát triển bền vững và bảo vệ môi trường.

Các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

- Nghiên cứu sâu hơn sự ảnh hưởng khác nhau của nhóm TKT làm tan và tiềm tan đến vi khuẩn chủ trong quá trình xâm nhiễm, từ đó đề ra hướng nghiên cứu mới về khả năng ứng dụng của TKT tiềm tan trong liệu pháp

- Nghiên cứu sâu hơn sự tương tác của TKT và vi khuẩn bao gồm tính kháng TKT của vi khuẩn.

- Nghiên cứu hiệu quả của TKT dạng kết hợp.

- Thesis title: Isolation and selection of bacteriophages with the ability to inhibit Vibrio spp. isolated from shrimp farming areas.

- Major: Biotechnology                               Code: 9420201

- Full name of PhD student: Le Hoang Bao Ngoc                  Year: 2019

- Scientific supervisor:

Main scientific supervisor: A/Prof.Dr. Truong Thi Bich Van

Assistant scientific supervisor: A/Prof. Dr. Le Viet Dung

- Educational institution: CanTho University

1. Content of thesis summary

Bacteria belongs to the Vibrio spp. and causes serious diseases in some aquacultural species. However, the use of antibiotics for disease prevention and treatment has shown adverse effects such as antibiotic-resistant bacteria, and antibiotic residues in products. Therefore, the thesis of "Isolation and selection of bacteriophages with the ability to inhibit Vibrio spp. isolated from shrimp farming areas” was conducted as a basis for researching alternative methods to antibiotics in the prevention of bacterial diseases, contributing to reducing antibiotic use in shrimp farming for sustainable agriculture, sustainable development, and environmental protection. The study is divided into three main sections to achieve this goal. Section one includes two experiments: (1). Isolation of Vibrio spp. and phages in shrimp samples and ponds taken in Soc Trang, Bac Lieu, and Kien Giang provinces and (2). Evaluation the host range and bacteriostatic effect of phage strains in laboratory conditions. Section two focuses on investigating the treatment ability of phages in a small tank shrimp culture model. Section three involves the study on the genetic characteristics of phages through sequencing and publishing the genomes of at least one phage line capable of inhibiting Vibrio spp. Using specialized bacteriophage study methods such as plaque assay with two layers of agar, drop method with two layers of agar, and bioinformatics analysis software BLASTN, BLASTX, and BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast); GeneMark (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/genemarks.cgi); tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAsc); CGView (https://proksee.ca/), the results include the isolation of 16 strains of Vibrio spp., selection of 3 phages (KGC2, KGBD, and KGA2) with a broad host range, and good infectivity against Vibrio spp. In in vivo conditions, phage 29k-A23 showed the ability to control diseases caused by Vibrio parahaemolyticus in white-leg shrimp (Litopenaeus vannamei) based on monitoring shrimp mortality rates, pathological signs and histopathology. The genome of the phage 29k-A23 is sequenced with 29.115 bp length, circular with a G+C ratio of 53,5%, encoding 40 ORFs, with no recognized tRNA genomes. The gene mapping indicates that the genes encoding the structural proteins of phage have all the basic components of a TKT tail, double-stranded DNA, belonging to the order Caudovirales, including ORF 9 encoding the sheath tail, and envelope typical for the phage group of the Peduoviridae family. In addition, the study also conducted sequencing of two phages ST5386 and ST22 (registered on the Gene bank with accession numbers PP41774.1 and OQ957557.1, respectively). The results showed the diversity of phages in nature, as all three phages belonged to distinct taxonomic groups.

2. The novel aspects from the thesis

The thesis is the first study conducted on the application of phage in inhibiting Vibrio spp. on shrimp in the Mekong Delta, the results achieved the following specific new points:

- Isolation of 3 strains of phages (29k-A23, ST5386, and ST22) with a wide host range and good ability to infect Vibrio spp.

- Experiments on shrimp models were conducted, and it was determined that 29k-A23 can control diseases caused by V. parahaemolyticus bacteria on white-leg shrimp (Litopenaeus vannamei).

- The results of 29k-A23 genome sequencing showed that 29k-A23 is 29115 kp long, circular with a G+C ratio of 53.5%, encoding 40 ORFs, in which no tRNAs genes were identified in the genome. The characteristic structural proteins showed that 29k-A23 is a phage with a tail, and double-stranded DNA, belonging to the Caudovirales order, in which ORF 9 encodes the sheath tail, the tail sheath is characteristic of the Peduoviridae family.

- The genomes of ST5386 and ST22 have also been sequenced and are available in the gene bank under accession numbers PP41774.1 and OQ957557.1, respectively.

3. Application prospects and suggestions for further study

Application prospects

Vibrio spp. is a serious disease in aquaculture. The antibiotic resistance of pathogenic bacteria and antibiotic residues in aquatic products has led to an urgent need for research on antibiotic alternatives. Phage is a virus that can parasitize and kill bacteria, exists abundantly in the natural environment, and is considered a potentially safe biological alternative to antibiotics. Therefore, the research results of the thesis will contribute to practical research, the application of phage in shrimp farming, limiting the use of antibiotics, towards safe agriculture, sustainable development, and environmental protection.

Suggestions for further study

- Further study on the different effects of virulent and temperate phages on host bacteria during infection, thereby proposing a new research direction on the application of temperate phages in therapy.

- Further study on the interaction of phage and bacteria, including bacterial resistance to phage.

- Study on the effectiveness of phage cocktail.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)