Tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh”.

 Tác giả: Trương Thị Hoa, Khóa: 2014

 Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản; Mã số: 62620110. Nhóm ngành: Nông-Lâm-Ngư nghiệp.

 Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Đặng Thị Hoàng Oanh - Trường Đại học Cần Thơ.

1. Tóm tắt nội dung luận án

Streptococcus iniae là một trong những tác nhân vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật thuỷ sản đặc biệt trên các loài cá nuôi ở nước mặn, lợ, ngọt. Nghiên cứu được thực hiện nhằm: (i) xác định đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm; (ii) tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá dìa, chẽm, rô phi có tính đối kháng với vi khuẩn S. iniae và (iii) xác định một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm khi có sử dụng vi khuẩn lactic.

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 42 chủng vi khuẩn từ 87 mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết và định danh là S. iniae bằng phương pháp sinh hóa, khuếch đại đoạn gen đặc hiệu và giải trình tự đoạn gen được khuếch đại. Kết quả gây bệnh thực nghiệm 2 chủng S. iniae HTA1 và HTA3 trên cá chẽm giống xác định giá trị LD₅₀ của 2 chủng HTA1 và HTA3 lần lượt là 1,9x10⁵ CFU/mL và 1,5x10⁵ CFU/mL. Sau 48 giờ cảm nhiễm với 2 chủng HTA1 và HTA3, cá chẽm có dấu hiệu bơi lờ đờ trên mặt nước, xuất huyết trên da và gốc vây, mắt lồi và xuất huyết. Sau 72 giờ, cá bắt đầu chết và tỉ lệ chết tích lũy cao nhất sau 8 ngày là 76,7% (chủng HTA1) và 80% (chủng HTA3). Trong khi đó ở lô đối chứng, cá không thể hiện dấu hiệu bệnh lý, không chết và không tái phân lập được vi khuẩn S. iniae. Kết quả nghiên cứu mô học cá chẽm cảm nhiễm S. iniae trong điều kiện thực nghiệm cho thấy vi khuẩn S. iniae gây xuất huyết và hoại tử trên các mô gan, thận, lách và não cá.

Tổng cộng có 61 chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ ruột cá rô phi, chẽm và dìa thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế. Các chủng vi khuẩn này đều là vi khuẩn Gram dương, hình que hoặc hình cầu, không hình thành bào tử, không di động, phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng phân giải CaCO₃ và không làm tan chảy gelatin. Trong 61 chủng vi khuẩn lactic có 28 chủng có khả năng kháng S. iniae, trong đó 3 chủng C21, D1 và D7 có khả năng kháng mạnh. Kết quả định danh 3 chủng C21, D1 và D7 bằng phương pháp khuếch đại đoạn gen đặc hiệu và giải trình tự đoạn gen được khuếch đại, xác định 3 chủng trên là Lactobacillus fermentum.

Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn đến các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S. iniae của huyết thanh cá chẽm được bố trí với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp. Nghiệm thức đối chứng âm (NT 1): Không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá; Nghiệm thức đối chứng dương (NT 2): Không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày thí nghiệm với liều tiêm là 1,9x10⁵ CFU/mL/cá; Nghiệm thức thí nghiệm 1 (NT 3): Bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 10⁹ CFU/g thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae; Nghiệm thức thí nghiệm 2 (NT 4): Bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 10⁹ CFU/g thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày cho ăn với liều tiêm là 1,9x10⁵ CFU/mL/cá. Tỷ lệ sống của cá được theo dõi ngay sau khi cảm nhiễm S. iniae đến 14 ngày sau cảm nhiễm. Các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S. iniae của huyết thanh cá chẽm được đánh giá vào 1, 14, 21 và 28 ngày thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đến ngày thứ 14 (trước khi gây cảm nhiễm S. iniae) số lượng tế bào hồng cầu và tổng bạch cầu của cá ở NT 3 và NT 4 cao hơn so với NT 1 và NT 2 (p<0,05). Đến ngày thứ 28 (sau khi gây cảm nhiễm S. iniae), số lượng hồng cầu của cá ở NT 2 thấp hơn so với NT 4 (p<0,05); số lượng tổng bạch cầu của cá ở NT 2, NT 3 và NT 4 cao hơn NT 1 (p<0,05). Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm ở NT 4 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với NT 1 và NT 2 (p<0,05). Kết quả xác định hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá chẽm cho thấy ở NT 3 và NT 4, sau 14 ngày bổ sung L. fermentum vào thức ăn, hoạt tính lysozyme cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với NT 1 và NT 2. Sau khi cảm nhiễm S. iniae ở NT 2 và NT 4, hoạt tính lysozyme ở NT 4 cao hơn nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT 2 (p>0,05). Tỷ lệ sống của cá sau 14 ngày cảm nhiễm S. iniae ở NT 2 và NT 4 lần lượt là 23,7% và 52,3%. Tỷ lệ bảo hộ khi bổ sung L. fermentum vào thức ăn là 37,5%.

Từ khóa: Cá chẽm (Lates calcarifer), huyết học, Lactobacillus fermentum, Streptococcus iniae

2. Những kết quả mới của luận án

Bệnh xuất huyết do S. iniae được nghiên cứu và mô tả về đặc điểm bệnh học trên cá chẽm nuôi tại Thừa Thiên Huế.

Đã định danh và lưu giữ được ba chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum từ ruột cá dìa và cá chẽm có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S. iniae gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm.

Sử dụng chủng vi khuẩn L. fermentum (C21) bổ sung vào thức ăn cho cá chẽm làm tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu giúp nâng cao khả năng đề kháng đối với vi khuẩn S. iniae gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm.

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp thông tin về bệnh xuất huyết do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm. Kết quả này là nguồn tài liệu tham khảo, bổ sung cho nghiên cứu và giảng dạy sinh viên trong các trường đại học.

Kết quả của luận án còn có ý nghĩa trong việc bổ sung nguồn tham khảo quan trọng về sử dụng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột một số loài cá nước lợ có tính đối kháng với vi khuẩn S. iniae và ảnh hưởng của vi khuẩn lactic đến một số chỉ tiêu huyết học ở cá chẽm.

Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn L. fermentum đến kháng thể và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm khi cảm nhiễm S. iniae; Nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn L. fermentum C21, D1 và D7 để tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh do S. iniae gây ra trên cá chẽm.

1. Summary

Streptococcus iniae is one of the most popular bacterial pathogens in aquatic animals, especially in marine, brackish and freshwater farmed fish. This study aimed to: (i) determine the pathogenic characteristics of Streptococcus iniae on barramundi; (ii) isolate and select the lactic acid bacteria recovered from the intestinal tracts of rabbit fish, barramundi, tilapia which antagonistic to S. iniae; and (iii) determine the haematological charateristics and the antagonistic activities of barramundi serum to S. iniae when lactic acid bacteria added.

The results showed that 42 bacterial isolates from 87 infected barramundi samples were recovered and identified as S. iniae via biochemical tests, specific 16S rRNA amplification and sequencing. The results of challenging tests of 2 isolate S. iniae HTA1 and HTA3 on barramundi indicated the LD₅₀ of 2 isolates HTA1 and HTA3 were 1.9x10⁵ CFU/mL and 1.5x10⁵ CFU/mL, respectively. After 48h challenged with the HTA1 or HTA3 strains by i.p injection, fish showed the typical clinical signs of diseases such as anorexia, haemorrhagic on body and fins as well as exophthalmia and haemorrhagic on eyes. After 48h i.p injection challenged, the mortality was observed. The cumulative mortality was the highest at 8 days post challenged, accounted for 76.7% (HTA1 isolate) and 80% (HTA3 isolate). Fish was healthy and no mortality was observed in the control group, as well as no S. iniae were recovered. Necrosis and haemorhagic were observed in liver, kidney, spleen and brain in S. iniae infected barramundi under experimental condition.

A collection of 61 lactic acid bacterial isolates were recovered from the intestinal tracts of rabbit fish, barramundi, tilapia in Thua Thien Hue province. All isolates were Gram positive, rod or cocci-shaped bacterium, no spore formation, non-mobile, negative for catalase and oxidase, CaCO₃ degration and no gelatin liquidation. Within the collection of these 61 lactic acid bacterial isolates, 28 isolates antagonistic to S. iniae, especially, the 3 isolated of C21, D1 and D7 showed strong antagonistic activity to S. iniae. The 3 isolated of C21, D1 and D7 were identified via specific 16S rRNA amplification and sequencing. The results showed that they are Lactobacillus fermentum.

The experiment to determine the effect of L. fermentum supplement to the barramundi diet to the haematology profile and the antagonistic ability of barramundi serum to S. iniae were designed in 4 treatments with triplicates. The negative control (NT 1): no L. fermentum supplement to the barramundi diet and no S. iniae i.p injection. The positive control (NT 2): no L. fermentum supplement to the barramundi diet and S. iniae i.p injection to the barramundi cavity after 14 days with the dose of 1.9x10⁵ CFU/mL/fish. The treatment 1 (NT 3): L. fermentum supplement to the barramundi diet at 10⁹ CFU/g in feed and no S. iniae i.p injection. The treatment 2 (NT 4): L. fermentum supplement to the barramundi diet at 10⁹ CFU/g in feed for 14 days before i.p injection to the barramundi with the dose of 1.9x10⁵ CFU S. iniae /mL/fish. Blood samples were colleted on day 1, 14, 21 and 28 for hamatological analysis and the ability of fish serum collected to identify the against of S. iniae. The results showed that the number of reb blood cells and total white blood cells of fish in NT 3 and NT 4 on day 14 (before challenged to S. iniae) were significantly higher than those from NT 1 and NT 2 (p<0.05). After challenged to S. iniae, the number of reb blood cells of fish in NT 4 was significantly higher than that from NT 2 on day 28; the number of total white blood cells of fish in NT 2, NT 3 and NT 4 were significantly higher than those from NT 1 on day 28 (p<0.05). The antagonistic ability of barramundi serum to S. iniae from NT 4 was significantly higher than those from NT 1 and NT 2 (p<0.05). The lysozyme activity of fish in NT3 and NT 4 treatments were significantly higher than those in NT 1 and NT 2 treatments (p<0.05). The lysozyme activity of fish in NT 4 treatment was not significantly higher than those in NT 2 treatment (p>0.05). The survival rate of fish in NT 2 and NT 4 treatments were 23.7% and 52.3%, respectively. The relative percentage of survival with L. fermentum supplement to the barramundi diet was 37.5%.

Keywords: Barramundi, haematology, Lactobacillus fermentum, Streptococcus iniae

2. Research Creativeness

The harmorrhagic diseases caused by S. iniae was studied and the histology of this diseases in barramundi in Thua Thien Hue province was described.

Three isolates of Lactobacillus fermentum from the intestinal tracts of barramundi and rabbit fish were recovered, and identified which showed strong antagonistic acitivity to the S. iniae.

1. L. fermentum isolate (C21) was used as supplement to the commercial diet to improve some innative immune system against the iniae pathogens on barramundi.
2. The applications/potential applications in barramundi farming, and the perspectives of this study

The study provided novel information about the haemorrhagic diseases caused by S. iniae on barramundi. These results can be used as references, supplement data for further research on S. iniae infection in fish.

The study also provided important information on the use of lactic acid bacteria which recovered from the instestinal tracts of some brackish water fish, had the antagonistic activity to S. iniae and the effect of lactic acid bacteria to the heamatological characteristics of barramundi to antagonistic to S. iniae.

Future perspectives: study on the effect of L. fermentum to the antibodies and immune response of barramundi infected to S. iniae; Study of the probiotic use of L. fermentum D1, D7 and C21 isolates in the prevention of S. iniae diseases on barramundi.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)