Tên đề tài: "Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh".

 Tác giả:  Nguyễn Thị Đấu, Khóa 2010 đợt 2.

 Chuyên ngành: Vi sinh vật học, Mã số: 62 42 01 07; Nhóm ngành - Khoa học sự sống.

 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu, Trường Đại học Cần Thơ.

 Thời gian bảo vệ: 08h00, Thứ bảy ngày 25 tháng 6 năm 2016.

 Địa điểm bảo vệ: Phòng 106, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học.

1.   Tóm tắt nội dung luận án

Vibrio cholerae là một loại vi khuẩn Gram âm có hình dấu phẩy với những chủng không gây bệnh và gây bệnh. Chủng gây nên bệnh lây lan mạnh nhất từ năm 1816 đến năm 1923 thuộc V. cholerae O1 type sinh học cổ điển. Những năm sau đó, chủng vi khuẩn khác thuộc type sinh học El Tor gây ra những trận đại dịch kéo dài trong thập niên 1970S, chủng mới nhất gây bệnh  được xác định vào năm 1992 thuộc type sinh học O139, chủng này cùng với chủng thuộc type sinh học O1 được xem là nguyên nhân của những vụ dịch xảy ra gần đây. Hiện nay, tuy có nhiều kháng sinh có thể điều trị được bệnh, nhưng hiệu quả kháng sinh có phần hạn chế do tình hình đa kháng thuốc gia tăng trong quần thể vi khuẩn này (CDC, 2005). Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh” được thực hiện với mục đích cung cấp thông tin cần thiết trong chiến lược sử dụng kháng sinh phù hợp nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm hiện tượng kháng thuốc và giảm chi phí trong điều trị bệnh.

Nghiên cứu được thực hiện qua việc phân lập vi khuẩn Vibrio spp. từ 160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước (50 mẫu nước biển, 50 mẫu nước sông, 50 mẫu nước ao nuôi tôm), 100 mẫu huyết heo và 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy thu thập tại bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh từ tháng 4 năm 2012 đến tháng 4 năm 2014.  Kỹ thuật PCR và các test sinh hoá (theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-1:2007) được sử dụng để định danh mức loài của vi khuẩn Vibrios, phản ứng ngưng kết được sử dụng để định type huyết thanh Vibrio cholerae. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được hai mươi lăm chủng vi khuẩn thuộcVibrio spp. bao gồm 6 chủng Vibrio cholerae (24%) (3 chủng từ nghêu, 2 chủng từ mẫu huyết heo và 1 chủng từ mẫu nước sông), 8 chủng thuộc loài Vibrio paraheamolyticus(32%), 4 chủng thuộc loài Vibrio vulnificus (16%), 5 chủng thuộc loài Vibrio fluvialis(20%) và 2 chủng thuộc loài Vibrio alginolyticus (8%). Kết quả định type huyết thanh học 6 chủng Vibrio cholerae đều thuộc type sinh học O1, với 50% (3/6)  dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính Ogawa. Không có chủng nào thuộc type sinh học O139.

Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide của gene 16S rRNA của 6 chủngVibrio cholerae phân lập được với chủng MS6 (Thái Lan), O395 (Ấn Độ), M66-62 (Indonesia), LMA 3894-4 (Brazil) và N16961 (Ấn Độ). Kết quả cho thấy 1 chủng trong 6 chủng này 100% tương đồng với 56 chủng; 99% tương đồng với 32 chủng và 99% tương đồng với 12 chủng gần. Riêng đối với 2 chủng mang gene kháng kháng sinh trong nghiên cứu này có trình tự nucleotide tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng và 94% với 02 chủng.

Tính kháng kháng sinh đối với 8 loại (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol và  vancomycin) của 6 chủng Vibrio cholerae được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010),kết quả cho thấy có 50% (3/6) chủng kháng streptomycin, 33% (2/6) chủng kháng tetracycline và trimethoprim-sulfamethoxazole. Với kỹ thuật PCR cho thấy có 2 chủng trong tổng số 6 chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA (gene mã hóa cho yếu tố kháng tetracycline), chưa phát hiện gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV vàdhfrI mã hoá yếu tố cho nhóm kháng sinh β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim .

So sánh Trình tự nucleotide gene tetA của chủng T1 và T3 so với chủng hoang dại (N16961) cho thấy có hiện tượng thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide trên 10 vị trí codon của gene tetA  của chủng T1 và trên 6 vị trí codon của chủng T3.

Kết quả thử nghiệm trên thỏ chứng minh chỉ số bám dính vi khuẩn V. cholerae T1 và T3 vào niêm mạc ruột đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả tại thời điểm 9 giờ sau khi cho uống vi khuẩn là 55.7±13.9 và 59.3±4.2 cao hơn đối với thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả (12.4±0.6 và 7.41±1.9). Tại thời điểm 16 giờ sau khi cho uống vi khuẩn, không có hiện tượng vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột trên tất cả thỏ được thí nghiệm. Thí nghiệm cho thấy chủng phân lập có tính kháng nguyên giống với kháng nguyên của vi khuẩn sử dụng làm vaccine phòng bệnh tả (mORCVAX) đang được sử dụng trong nước.

Từ khoá: Vibrio cholerae, gene, kháng, kháng sinh, phân lập

2.  Những kết quả mới của luận án

- Phân lập được 25 chủng Vibrio spp. bao gồm 6 chủng thuộc loài V. cholerae, 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus, 4 chủng thuộc loài V. vultificus, 5 chủng thuộc loài V. fluvialis và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus. Tất cả 6 chủng này đều thuộc type sinh học O1, trong đó có 50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính với Ogawa. Không có chủng nào thuộc type sinh học O139.

- Các chủng Vibrio cholerae đề kháng với nhiều loại kháng sinh, có 50% (3/6) đề kháng với streptomycin, 33% (2/6) đề kháng với tetracycline và trimethoprim-sulfamethoxazole. 2 chủng (T1 và T3) trong 6 chủng có chứa gene kháng kháng sinh tetracycline (genetetA). Chưa phát hiện được gene blaSHV, gene aac(3)-IV and gene dhfrI mã hóa cho yếu tố đề kháng đối với β-lactam, aminoglycosid và trimethoprim.

- Thí nghiệm cho thấy 2 chủng (T1 và T3) trong 6 chủng có tính kháng nguyên giống với kháng nguyên của vi khuẩn sử dụng làm vaccine phòng bệnh tả (mORCVAX) đang được sử dụng trong nước.

3. Các ứng dụng/ khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

Đề tài chứng minh có sự hiện diện của V. cholerae trên mẫu nghêu, mẫu huyết heo và mẫu nước sông tại tỉnh Trà Vình. Điều này cảnh báo nguy cơ nhiễm V. cholerae trên người.

Kết quả khảo sát tính kháng kháng sinh của V. cholerae trong nghiên cứu này là những dữ liệu cần thiết trong việc lựa chọn kháng sinh để điều trị bệnh.

Những kết quả nghiên cứu này đóng góp cho việc cập nhật những kiến thức dùng trong nghiên cứu và giảng dạy tại các trường Đại học Y Dược và Đại học Nông nghiệp (Chăn nuôi và Thuỷ sản) về các bệnh lây nhiễm từ thực phẩm.