Tiêu đề: “Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long”.

Tác giả:  Quách Văn Cao Thi, Khóa 2012 đợt 1.

 Chuyên ngành: Vi sinh vật học, Mã ngành: 62420107; Nhóm ngành: Khoa học sự sống.

 Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Từ Thanh Dung, Trường Đại học Cần Thơ.

 Thời gian bảo vệ: 8 giờ 00, Thứ sáu ngày 25 tháng 8 năm 2017.

 Địa điểm bảo vệ: Phòng Bảo vệ luận án tiến sĩ (Phòng họp 3, lầu 2, Nhà điều hành), Khu II – Trường Đại học Cần Thơ

1. Tóm tắt nội dung luận án

1.          Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích xác định 1 số đặc điểm bệnh học nhiễm kép và cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở ĐBSCL. Kết quả của luận án đã phân lập được 141 chủng vi khuẩn, gồm 67 chủng vi khuẩn E. ictaluri  và 74 chủng vi khuẩn A. hydrophila đã được phân lập và định danh từ các mẫu cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết dựa trên các kỹ thuật sinh hóa truyền thống và sinh học phân tử (PCR và giải trình tự gen). Trong số các chủng vi khuẩn thu thập được thì có 22/67 (chiếm 32,84%) chủng E. ictaluri và 22/74 (chiếm 29,73%) chủng A. hydrophila đã được phân lập từ cá tra nhiễm kép 2 loại bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết.

            Kết quả thí nghiệm xác định độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophilacho thấy cá tra sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu biểu hiện bệnh đặc trưng của 2 loài vi khuẩn. Kết quả đã xác định được độc lực và liều gây chết LD₅₀ của 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri 1ED3, 3ED3, 8ED3 và 10ED3 lần lượt là 1,58x10⁴, 1,23x10⁵, 1,67x10⁴ và 1,19x10⁵ CFU/mL, trong khi đó độc lực và liều gây chết LD₅₀ của 4 chủng vi khuẩn A. hydrophila 1A3, 2A3, 4A3 và 5A3 lần lượt là 1,47x10⁴, 2,37x10³, 1,29x10³ và 1,52 x10⁴ CFU/mL.

            Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm kép 2 chủng 1ED3 và 4A3 trên cá tra bằng phương pháp ngâm và tiêm cho thấy việc kết hợp 2 chủng vi khuẩn này đã làm gia tăng độc lực gây bệnh của vi khuẩn. Kết quả bệnh bộc phát mạnh với tỷ lệ cá chết cao và thời gian cá bắt đầu chết cũng sớm hơn so với phương pháp cảm nhiễm đơn. Cá nhiễm kép trong nghiên cứu này có các dấu hiệu bệnh tương tự với các dấu hiệu của cá bệnh ngoài tự nhiên và thường là các dấu hiệu kết hợp của 2 loại bệnh này. Kết quả nhuộm Haematoxylin và Eosin cho thấy có sự biến đổi cấu trúc tế bào và vùng mô của các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng với các hiện tượng như sung huyết, xuất huyết và hoại tử mất cấu trúc. Tuy nhiên, cấu trúc tế bào và vùng mô ở các mẫu da-cơ và mang của cá bệnh không hoặc ít bị biến đổi trong thời gian theo dõi thí nghiệm.  

   Kết quả thực hiện kháng sinh đồ trên 67 chủng E. ictaluri và 74 chủng A. hydrophila cho thấy vi khuẩn E. ictaluri đã kháng cao với các kháng sinh như CHL (94,03%), FFC (94,03%),  TET (92,54%), STR (74,63%), ENR (71,64%), GEN (46,27%) và NOR (46,27%). Trong khi đó, vi khuẩn A. hydrophila kháng cao với với các kháng sinh như AMP (100%), AMO (100%), CFL(100%), TET (90,54%), FFC (60,81%) và NEO (54,05%). Đặc biệt, kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trong nghiên cứu này đều thể hiện tính đa kháng thuốc. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trong nghiên cứu thường xuyên tiếp xúc với kháng sinh trong môi trường nuôi cá tra với chỉ số đa kháng (MAR) ở các địa điểm thu mẫu đều lớn hơn 0,2.

   Nghiên cứu đã xác định cơ chế phân tử của hiện tượng đa kháng thuốc của vi khuẩn như hiện diện của các integron nhóm 1 ở 2 loài vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri với tỷ lệ lần lượt là 51,35% và 35,82%. Sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, luận án đã xác định nhiều vùng gene cassette mã hóa cho các enzyme dihydrofolate reductase, aminoglycoside adenyltransferase, aminoglycoside N(6')-acetyltransferase và β-lactamase kháng lại nhiều loại kháng sinh ở vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri. Ngoài ra, sự hiện diện của các gen kháng tetracyline như tetA, tetB,, tetC, tetG, tetK và tetS, gen kháng sulfonamide và florfenicol đã được phát hiện ở vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri có khả năng truyền gen kháng thuốc của chúng sang vi khuẩn E. coli trong môi trường ao nuôi cá tra. Tuy nhiên, giữa các chủng vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri không có khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc cho nhau.  

    

   2. Những kết quả mới của luận án

            Luận án góp phần cung cấp các thông tin quan trọng về các đặc điểm bệnh học của việc nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra nuôi ở ĐBSCL như thời gian vi khuẩn gây bệnh, tỷ lệ cá chết và các đặc điểm bệnh học ở mức đại thể và vi thể như dấu hiệu biểu hiện bệnh (bên ngoài và bên trong) và các biến đổi của 1 số cơ quan cá bệnh về mặt mô bệnh học.

   Cung cấp các thông tin mới về tính nhạy cảm kháng sinh, đặc biệt là hiện trạng đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL. Ngoài ra, luận án còn cung cấp các thông tin liên quan đến khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn ở mức độ phân tử như xác định 1 số gen kháng tetracycline và florfenicol mà các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào kiểu hình kháng thuốc của vi khuẩn.

   Luận án góp phần làm sáng tỏ cơ chế đa kháng thuốc ở mức phân tử của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophilanhư xác định sự hiện diện của các plasmid kháng thuốc, các integron nhóm 1 cũng như các vùng gene cassette của vi khuẩn mã hóa cho các gen kháng thuốc khác nhau. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila có khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc cho vi khuẩn E. coli thông qua các plamid và integron. Tuy nhiên, giữa 2 loài vi khuẩn này thì không có khả năng tiếp hợp và trao đổi gen kháng thuốc với nhau.  

   3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

   Khả năng ứng dụng trong thực tiễn:

   Nghiên cứu đặc điểm bệnh học cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila là cơ sở và tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tìm ra các giải pháp kiểm soát, quản lý dịch bệnh và cuối cùng là đưa ra các biện pháp phòng trị bệnh gan thận mủ, bệnh xuất huyết trên cá tra hiệu quả và an toàn. Đặc biệt, kết quả của nghiên cứu này là cơ sở khoa học để ứng dụng công nghệ cao cho việc sản xuất vaccine đa giá có thể phòng cùng lúc 2 loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm này trên cá tra trong tương lai.

   Các thông tin về tính nhạy cảm kháng sinh và hiện trạng đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila giúp người nuôi cá có thể lựa chọn kháng sinh thích hợp trong việc điều trị bệnh 1 cách hiệu quả và tiết kiệm được chi phí điều trị. Ngoài ra, việc làm sáng tỏ bản chất phân tử của cơ chế đa kháng thuốc, khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn với vi khuẩn E. coli và giữa 2 loài vi khuẩn này với nhau sẽ giúp cho các nhà khoa học và cơ quan quản lý thuốc kháng sinh có các giải pháp tương lai để ngăn chặn và kiểm soát sự bùng phát hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn hiện nay nhằm hướng đến việc sản xuất cá tra an toàn và bền vững.

   Các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

   Cần xác định các gen độc lực và các gen kháng thuốc khác như nhóm β-lactam, quinolone và aminoglycoside) của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL.

            Tiếp tục nghiên cứu khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc giữa 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên nhiều chủng vi khuẩn để có kết luận đầy đủ và chính xác hơn về khả năng này của 2 loài vi khuẩn trong tự nhiên.

     Người hướng dẫn                                                            Nghiên cứu sinh

    

        PGS.TS. TỪ THANH DUNG                                         QUÁCH VĂN CAO THI

    

   INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

    

   Dissertation name: “Study on pathological characteristics of coinfection and mechanisms of multiple antibiotic resistance in Edwardsiella ictaluri  and Aeromonas hydrophila cause diseases on striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) intensively cultured in the Mekong Delta”.   

   Specialization: Microbiology                             Code: 62 42 01 07

   PhD student: Quach Van Cao Thi

   Scientific supervisor: Assoc. Prof. Dr. Tu Thanh Dung.

   Academic institute: Institute of Research and Development Biotechnology, Can Tho University

   1. Thesis summary

            The study’s purpose was to determine the pathological characteristics of the coiifection and the mechanisms of multiple antibiotic resistance in E. ictaluri and A. hydrophila cause diseases on striped catfish farmed in the Mekong Delta. The results showed that a totall of 141 strains of E. ictaluri and A. hydrophila from bacillary necrosis of Pangasius and hemorrhagic infected fish samples were isolated and identified. In which, there were 67 E. ictalur and 74 A. hydrophila strains by using conventional biochemical tests (including the API 20E identification kit) and molecular biology techniques (PCR and gene sequencing). Among these, there were 22 strains of E. ictaluri and 22 strains of A. hydrophil recovered from fish samples infected by both diseases. The results of gene sequencing showed that the homology of isolated strains ranged from 99 to 100% for E. ictaluri and from 98 to 100% for A. hydrophilastrains compared to bacterial sequences on the NCBI Genbank.

   The virulence and pathogenicity of E. ictaluri and A. hydrophila strains were evaluated by intraperitoneal injection method with bacterial densities from 10² to 10⁶ CFU/fish. The results showed that the moribund fish displayed typical clinical signs of single bacterial infection. Tiny white spots appeared on internal organs such as livers, kidneys and spleens of fish exposed to E. ictaluri. Meanwhile, the exophthalmic eyes and petechial spots appeared around the fin, mouth, anus and abdominal pinkish fluid were recorded in hemorrhagic disease infected fish by A. hydrophila. The virulence and LD₅₀ values of four strains of E. ictaluri (1ED3, 3ED3, 8ED3 and 10ED3) were 1.58x10⁴, 1.23x10⁵, 1.67x10⁴, and 1.19x10⁵ CFU/mL, respectively; while the virulence and LD₅₀ values of four strains of A. hydrophila(1A3, 2A3, 4A3 and 5A3) were 1.47x10⁴, 2.37x10³, 1.29x10³ and 1.52x10⁴ CFU/mL, respectively.

            Two strains (1ED3 and 4A3) with the highest virulence were chosen to conduct coinfection experiments by immersion and injection methods. The results indicated that the combination of two bacterial species significantly increased the virulence of bacteria compared to single bacterial infection. The challenge tests of two bacteria had strong outbreaks with high mortality rates (cumulative percentage mortalities in combined treatments ranged from 80% to 93.33%) and faster death fish compared to single immersion and injection. The cross signs of experimented were similar to those of natural infected fish. The typical signs of diseased fish included bulging eyes, petechial hemorrhages around the fin, mouth, anus, pinkish fluid in abdominal cavity and tiny white spots in the internal organs such as livers, kidneys, and spleens. Additionally, Haematoxylin and Eosin staining results also showed histopathological changes in tissues of organs such as the livers, kidneys and spleens with the phenomenon of congestion, haemorrhage and structural lose necrosis. However, the structural changes strongly took place in the liver, kidney and spleen tissues, whereas muscle-skin and gill of infected fish were significantly not or less affected through the whole experiment.

   The study of antibiotic susceptibility of 67 strains of E. ictaluri and 74 strains of A. hydrophila was performed on 15 different antibiotics by the disk diffusion method. The results showed that most of E. ictaluri strains were relatively highly resistant to chloramphenicol (94.03%), florfenicol (94.03%), tetracycline (92.54%), streptomycin (74.63%), enrofloxacin (71.64%), gentamicin (46.27%) and norfloxacin (46.27%). Meanwhile, A. hydrophila was relatively high resistant to tetracycline (90.54%), florfenicol (60.81%) and neomycin (54.05%) and completely resistant to ampicillin, amoxicillin, cefalexin and trimethoprim/sulfamethoxazole. Particularly, all of two bacterial strains in this study expressed multiple drug resistance. Besides, this research found that the bacterial strains frequently exposed to antibiotics had the MAR index (multiple antibiotic resistance) greater than 0.2 in all sampling sites.

   This study detected genetic elements related to mechanism of multi-drug resistance of E. ictaluri and A. hydrophilasuch as the presence of class 1 integrons with the ratio of 51.35% and 35.82%, respectively. Using PCR and gene sequencing, the study identified many cattsette gene regions encoding to dihydrofolate reductase, aminoglycoside adenyltransferase, aminoglycoside N(6')-acetyltransferase and β-lactamase enzymes resistant to different antibiotics in both bacteria. Furthermore, this research found the presence of tetracycline resistance genes such as tetA, tetB,, tetC, tetG, tetK and tetS of two bacterial species with the ratio of 82.5%, 8.75%, 31.25%, 33.75%, 8.75% and 7.5%, respectively; while the frequency of occurrence of florfenicol resistance gene in A. hydrophila and E. ictaluri was 72.5% and 87.5%, respectively. Besides, this study showed that A. hydrophila and E. ictaluri strains were capable of transferring their resistance genes into E. coli collected from catfish aquatic environment. However, conjugation and transferability of drug resistance genes between A. hydrophila and E. ictaluri were not found in this research.

   2. Research creativeness

            The study provided important information on pathological characteristics of the coinfection of E. ictaluri and A. hydrophila on striped catfish in the Mekong delta as well as the internal and external clinical signs, mortality, and the structural changes of the infected organs found on diseased fish.

   The study also provided the updated information on the antibiotic susceptibility, especially the current situation of the multi-drug resistance of E. ictaluri and A. hydrophila on the striped catfish. Besides, the study also gave some new information related to molecular bacterial antibiotic resistance such as identification of tetracycline, sulfonamides (sul1, sul2 and sul3 genes), and florfenicol resistance genes that previous researches only concentrated on their antibiotic resistance phenotypes.

   More importantly, the study also revealed the mechanism of multi-drug resistance on E. ictaluri and A. hydrophilarelated to genetic elements such as the presence of resistance plasmids, class 1 intergons as well as several cassette gene arrays encoding different antimicrobial resistance genes. Additionally, the study revealed that E. ictaluri and A. hydrophila could conjugate and transfer their antibiotic resistance genes into E. coli originated from catfish aquatic environments by plasmids and integrons. This ability, however, were not found between E. ictaluri and A. hydrophila.

   3. Practical implications and further research

   Practical implications:

   The research on coinfection pathological characteristics on E. ictaluri and A. hydrophila provide fundamental information for the study subsequent research to control and manage the BNP and hemorrhagic disease on striped catfish effectively. Particularly, the study’s results were scientific basis in applying high technology to produce vaccine which can prevent both bacteria in the future.

   The updated information about antibiotic susceptibility and the multi-drug resistance of E. ictaluri and A. hydrophilacan support fish famers to choose and use suitable antibiotic for the diseased treatment. Besides, by revealing the molecular mechanism of multi-drug resistance bacteria, the transmission of antimicrobial resistance genes through intergons and plasmids as well as transferability of E. ictaluri and A. hydrophila into E. coli can provide necessary information for scientists and managers to control the outbreak of antibiotic resistance in bacteria for the sustainable striped catfish culture.

   Further research:

   It is needed to determine the virulence genes and identify other antibiotic resistance genes such as β-lactam group, quinolones and aminoglycosides of these two bacterial species in the Mekong Delta.

   Study on the conjugation and transmission of antibiotic resistance genes between these two bacterial species with more different strains to exactly confirm about this possibility in nature.

    

             Scientific supervisor                                                    PhD student

     

    

   Assoc. Prof. Dr. TU THANH DUNG                        QUACH VAN CAO THI

>> Xem chi tiết nội dung luận án

 >> Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo.