Tên đề tài: “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng Sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” .

 Tác giả: Phạm Thị Ngọc Nga, Khóa: 2013

 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 9420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống

 Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Trung Kiên, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.

 Thời gian bảo vệ: 8 giờ 00, thứ sáu ngày 08 tháng 6 năm 2018.

 Địa điểm bảo vệ: Phòng Bảo vệ luận án tiến sĩ (Phòng họp 3, lầu 2, Nhà điều hành), Khu II – Trường Đại học Cần Thơ

1. Tóm tắt nội dung luận án

Nghiên cứu đã ứng dụng phối hợp 3 kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại: lai dò ngược (RDB), giải trình tự gen và kỹ thuật khuếch đại đa đoạn dò (MLPA) để xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh β-Thal và các thể bệnh trên 341 bệnh nhân thuộc 4 nhóm dân tộc: 307 Kinh, 20 Khmer, 7 Hoa và 7 Chăm. Kết quả: sự phối giữa 3 kỹ thuật đã giúp 100% bệnh nhân đã tìm được đột biến phù hợp với điện di và chẩn đoán trên lâm sàng. Có 609/682 alen tìm được đột biến và 17 kiểu đột biến đã được tìm gặp trên các bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long: 97,2% các đột biến thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam; 6 kiểu đột biến thuộc dạng không phổ biến (2,2%) và 3 kiểu đột biến mới (0,6%): Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C. 17 kiểu đột biến này đã tạo đến 42 kiểu phối hợp đột biến gen trong 4 thể bệnh β-Thal của 341 đối tượng nghiên cứu bao gồm: đồng hợp tử, dị hợp tử kép, thể phối hợp HbE/β-Thal và β-Thal dị hợp tử. Trong đó, thể phối hợp HbE/β-Thal là thể bệnh phổ biến nhất (58,1%).

Bằng cách sử dụng công thức máu và điện di Hb để sàng lọc, các kỹ thuật RDB, MLPA tìm đột biến β-Thal và GAP-PCR tìm đột biến α-Thal trên 263 đối tượng gồm: 12 bệnh nhân β-Thal và 251 người nhà, nghiên cứu đã xây dựng được 12 phả hệ để theo dõi sự di truyền bệnh b-Thal (7 dân tộc Kinh, 03 dân tộc Khmer, 1 dân tộc Chăm và 1 dân tộc Hoa). Đồng thời, nghiên cứu cũng đã xác định được tỷ lệ kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh này trong 12 phả hệ. Kết quả: 100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường theo quy luật di truyền của Mendel. Trong 12 phả hệ, có 145 alen mang đột biến, có 6 kiểu đột biến được tìm gặp gồm 5 đột biến gây bệnh b-thal: β^HbE (35,8%), β^Cd41/42 (32,4%), β^Cd17 (17,9%), β^-28(6,2%), (δβ)^del (2,1%) và một đột biến gây bệnh α do mất đoạn –SEA. Ngoài ra, có 91/251 (36,3%) người mang gen bệnh và 7 thể bệnh được phát hiện trong phả hệ: các thể bệnh β-Thal đồng hợp tử, phối hợp HbE/β-Thal, β-Thal dị hợp tử kép đều có kiểu hình thiếu máu nặng và cần truyền máu phụ thuộc. Các thể bệnh còn lại chỉ biểu hiện thiếu máu nhẹ, không cần truyền máu.

Với nội dung tư vấn di truyền, có 75 đối tượng mang gen bệnh β-Thal từ 18 đến 65 tuổi trong 12 phả hệ đã tham gia nghiên cứu. Các đối tượng được đánh giá kiến thức liên quan đến bệnh β-Thal theo bộ 13 câu hỏi tự điền và được soạn sẵn. Kiến thức đánh giá trước và sau khi bác sĩ tư vấn trên 3 lĩnh vực: kiến thức về bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về phòng bệnh (3 câu hỏi). Kết quả ghi nhận cả 3 lĩnh vực kiến thức đã được tăng lên có ý nghĩa thống kê (p<0,001) sau tư vấn. Ngoài ra, sau tư vấn có 3 cặp vợ chồng mang gen ở 3 phả hệ người Kinh đang mang thai trong giai đoạn đầu (<24 tuần) chấp nhận sàng lọc trước sinh. Kết quả 1/3 thai được tư vấn chấm dứt thai kỳ do mang kiểu gen đồng hợp tử với đột biến Cd41/42 -TTCT. Một thai nhi song sinh và một thai nhi khác mang kiểu gen dị hợp được tư vấn tiếp tục thai kỳ. Các bé chào đời khỏe mạnh với kết quả sàng lọc sau sinh tương tự như trước sinh.

Như vậy, tư vấn di truyền kết hợp với khai thác tiền sử gia đình, sàng lọc người mang gen và sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử thích hợp xác định đột biến cho chẩn đoán trước sinh là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhằm giảm nhanh tỷ lệ β-Thal thể nặng chào đời và nâng cao chất lượng dân số trong khu vực.

2. Những kết quả mới của luận án:

- Nghiên cứu xác định được tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và đặc điểm di truyền của bệnh ở một số phả hệ của bệnh nhân b-Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long.

- Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới:

+ Phối hợp kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau: công thức máu, điện di Hb, RDB, giải trình tự, MLPA để xác định các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân b-Thal một cách hiệu quả, nhanh chóng. Kết quả đột biến này sẽ là cơ sở vững chắc để xác định các thể bệnh b-Thal trong các phả hệ và hỗ trợ tư vấn di truyền hiệu quả hơn.

+ Nghiên cứu thực hiện khá toàn diện về bệnh b-Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu đột biến), sự di truyền bệnh qua các thế hệ, tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán trước sinh cho người mang gen.

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

3.1. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn của nghiên cứu

* Về mặt khoa học:

- Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh β-Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân β-Thal khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long.

- Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.

* Về mặt xã hội:

- Nâng cao hiểu biết của người dân về bệnh b-Thal từ đó góp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao chất lượng sống, kéo dài tuổi thọ cho người bị bệnh thalassemia.

- Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.

3.2. Các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

Cần thực hiện thêm các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để tìm hiểu đột biến ở dân tộc ít người: Chăm, Hoa,… sống tại khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long.

Nghiên cứu sàng lọc người mang gen bệnh ở cộng đồng và trong các gia đình có người bệnh bằng các xét nghiệm đơn giản.

Thực hiện các nghiên cứu nhằm xây dựng các chương trình phòng chống bệnh thalassemia, chủ yếu tập trung vào các bước tầm soát, tư vấn tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh để hạn chế sự chào đời của trẻ β-Thal thể nặng.

1. Summary of thesis content

The research has applied the combination of three modern molecular biology techniques: reverse dot blot (RDB), sequencing and multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to determine the rates of β-globin gene mutations and types of disease in 341 patients of β-Thal in 4 ethnic groups: Kinh (307), Khmer (20), Chinese (7) and Cham (7) in the Mekong Delta. Results: The combination of these three techniques helped 100% of patients find mutation types suitable for Hb electrophoresis and clinical features. There were 609/682 alleles were found with mutation and 17 mutation types were found in patients in the Mekong Delta: 97.2% of the mutations belonged to eight common mutations of Vietnam; six types of rare mutations accounted for 2.2% and three new mutations accounted for 0.6% (Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C). 42 types of gene mutations was resulted from 17 mutations in four β-Thal disease types in 341 subjects, including homozygous, compound heterozygous β-Thal, HbE/β-Thal and heterozygous β-Thal. HbE/β-Thal disease always had the highest frequency among the four β-Thal disease types (58.1%).

By using the blood and Hb electrophoresis for screening, RDB techniques, MLPA for β-Thal mutations and GAP-PCR for α-Thal mutations in 263 subjects (12 β-Thal patients and 251 family members), the research established 12 pedigrees to monitor the hereditary β-Thal including  7 Kinh ethnic, 3 Khmer ethnic, 1 Cham ethnic and 1 Chinese ethnic. At the same time, the study also determined the rates of mutation, β-Thal disease types, and hematologic patterns of these disease types in the 12 pedigrees. Results: All pedigrees inherited in an autosomal recessive fashion following Mendel's rule. There were 145 mutant alleles, in which six mutations were found, including five b-Thal mutations: β^HbE (35,8%), β^Cd41/42 (32,4%), β^Cd17 (17,9%), β^-28(6,2%), (δβ)^del (2,1%) and one α-Thal mutation: –SEA. Besides, there were 91/251 (36,3%) gene carriers and seven types of β-Thal disease identified in the pedigrees: three out of seven types including β-Thal homozygotes, compound heterozygotes of HbE/β-Thal and compound heterozygotes β-Thal had a major anemia and require dependent blood transfusion. The other of the disease showed minor anemia and no blood transfusion. It’

The study also provided genetic counseling for subjects, there were 75 β-Thal carriers from 18 to 65 year olds in the twelve pedigrees were genetically advised. The subjects’knowledge of β-Thal disease was assessed with a set of 13 prepared questions. The knowledge were assessed before and after consultation with the doctor in three areas of knowledge of β-Thal disease (5 questions); knowledge of patient care (5 questions); knowledge of disease prevention (3 questions). Results: 100% of knowledge of β-Thal disease, patient care and of the prevention of disease increased significantly (p<0.001) after counseling. Three carrier couples participated in prenatal diagnosis. One couble was advised to terminate their pregnancy due to carrying β-Thal major with two Cd41/42 –TTCT mutations on β-globin gene.

Therefore, genetic counseling combined with family history, screening of gene carriers and using of various molecular biology techniques for prenatal diagnosis is an effective way to rapidly reduce the β-Thal major, to prevent the disease and to improve of the community quality of life.

2. Research creativeness

- The study investigated b-Thal disease in all four ethnic groups: Kinh, Cham, Khmer, Chinese in the Mekong Delta.

- The study has offerd a new oriented research, including the following features:

+ The study combined a variety of molecular biology techniques to identify the most pathogenic mutations in patients with b-Thal quickly and efficiently. These mutation results were a solid base for identifying b-Thal types in the pedigree and providing more effective genetic counseling.

+ The study was a comprehensive research on b-Thal disease in which the folloing tasks were carried out indentification of the cause of the disease (type of mutations) and genetic inheritance in generations, genetic counseling and prenatal genetic diagnosis for gene carriers.

3. Practical implications and further research

3.1. Practical implications:

* Scientific and educational values:

- Providingore scientific data on the rate of β-Thal gene mutations and genetic inheritance in the pedigree of some families in the Mekong Delta are available diminished.

- Making the premise for the following studies.

* Social values:

- Improving people's knowledge of b-Thal disease contributed to morbidity, improvement of the quality of life and extension of life expectancy for people with major b-Thal.

- By Screening and prenatal diagnosis limiting the birth of the children of β-thal major, reducing the burden on families and society.

3.2. Further research

The study suggests the following further actions:

Dissemination information about thalassemia and the severity of the disease in the community.

Study the screening of gene carriers in the community and in families’patients by simple tests.

Campaigns on Thalassemia prevention are in need of development, focusing on screening, prenatal counseling and prenatal diagnosis for major β-thal detection and limination in the next generations.

>> Xem chi tiết nội dung luận án

>> Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo.