Tên đề tài: “Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố Cần Thơ”.

 Tác giả: Trịnh Thị Hồng Của, Khóa: 2013

  Chuyên ngành: Công nghệ sinh học; Mã số: 62420201. Nhóm ngành: Khoa học sự sống.

 Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trần Ngọc Dung - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

 Người hướng dẫn phụ: GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi - Trường Đại học Y Hà Nội

1. Tóm tắt nội dung luận án

            Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là khối u ác tính xuất phát chủ yếu từ lớp tế bào biểu mô phủ vòm mũi họng. Bệnh UTVMH thường được chẩn đoán muộn vì nhiều lý do và dẫn đến kết quả điều trị kém đi và làm tỷ lệ tử vong tăng cao. Các nghiên cứu trước cho thấy, trong các yếu tố sinh bệnh chính, nhiễm virus Epstein-Barr (EBV) được xem là yếu tố quyết định trong bệnh sinh học của UTVMH nên được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, đặc biệt là gen Latent Membrane Protein 1 (LMP1) EBV được tìm thấy trong hầu hết các mô sinh thiết vòm của bệnh nhân UTVMH. Kiểu đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV có liên quan chặt chẽ cho sự phát triển khối u ác tính tại biểu mô vòm mũi họng ở các bệnh nhân (BN) có nhiễm EBV. Bên cạnh đó, do đặc điểm bệnh sinh học của UTVMH còn liên quan đến yếu tố cơ địa gen Human Leukocyte Antigen (HLA) nhạy cảm với UTVMH và điều này đã làm nên đặc tính khác nhau về tỷ lệ bệnh giữa các khu vực địa lý. Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ hiện diện và đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH và xác định tần suất phổ biến của các alen HLA trên các BN UTVMH nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang phân tích trên 108 mẫu mô sinh thiết vòm của BN đã được chẩn đoán xác định là UTVMH tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ. Nghiên cứu thực hiện kỹ thuật PCR cổ điển với cặp mồi đặc hiệu LMP1 (168373-168174) và kỹ thuật giải trình tự gen LMP1 để phát hiện gen và kiểu đột biến gen LMP1 EBV.

Kết quả cho thấy, tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết của BN UTVMH là 64,8% (70/108), kiểu đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 qua kỹ thuật điện di sản phẩm khuếch đại là 72,9% (51/70) và nghiên cứu đã xác nhận kết quả đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 bằng kỹ thuật giải trình tự gen LMP1 với tỷ lệ là 75,8% (25/33). Vị trí đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV là 168266-168295 và một số đột biến thay thế nucleotide như 168225A>T, 168295T>A, 168308A>G, 168320T>C.

Bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide probes (PCR-SSO) nghiên cứu đã xác định tần suất của các alen HLA xuất hiện cao ở BN nghiên cứu là -A*02 (40,4%), -A*11 (21,2%), -A*24 (21,2%); -B*15 (25%), -B*46 (23,1%), -B*38 (9,6%), -B*07 (7,7%); -DRB1*12 (17,3%) và -DRB1*09 (13,8%); -DQB1*03 (44,7%), -DQB1*05 (21,4%) và -DQB1*06 (17,9%); -DQA1*01 (35,7%), -DQA1*03 (28,6%) và -DQA1*06 (21,4%). Người mang alen -DRB1*08 có nguy cơ mắc bệnh UTVMH gấp 8 lần người bình thường (OR = 8,098, p < 0,05), ngược lại người mang alen -DRB1*12 và -DQB1*03 thì giảm nguy cơ mắc bệnh lý này (OR = 0,335, p < 0,05; OR = 0,367, p < 0,05) so với người không mang các alen này. Liên quan giữa kiểu đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nhưng không có liên quan giai đoạn bệnh(p > 0,05). Người mang alen HLA-B*15 có nguy cơ đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với những người không mang alen này. Riêng alen HLA-A*02 có liên quan đến thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa (p < 0,05) và alen HLA-B*15, HLA-DQA1*03 làm giảm 12,2%, 17,8% nguy cơ mắc UTVMH ở giai đoạn muộn trên bệnh nhân nghiên cứu.

2. Những kết quả mới của luận án

- Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên về bệnh sinh học UTVMH tại thành phố Cần Thơ nói riêng và vùng Đồng bằng sông Cửu Long, miền Nam của Việt Nam nói chung. Công trình đã cung cấp các số liệu khoa học về tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV, tỷ lệ các kiểu đột biến, đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV ở mẫu sinh thiết mô vòm bệnh nhân UTVMH. Từ đó, đã làm rõ hơn vai trò của gen LMP1 EBV trong bệnh sinh học UTVMH.

- Luận án cũng là công trình đầu tiên xác định được tần suất các alen HLA xuất hiện phổ biến của bệnh nhân UTVMH cư trú tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, miền Nam của Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-SSO.

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

3.1. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn của nghiên cứu

- Ứng dụng triển khai kỹ thuật khuếch đại gen LMP1 EBV giúp nhận định đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV trên mẫu sinh thiết mô UTVMH tại các bệnh viện, bổ sung một công cụ xét nghiệm giúp cho chẩn đoán, tiên lượng bệnh nhân UTVMH. Ngoài ra, luận án cũng cung cấp những dữ liệu khoa học về sự khác nhau của thể mô bệnh học UTVMH ở khu vực Đồng bằng Cửu Long với các vùng khác của Việt Nam.

- Làm cơ sở dữ liệu tham khảo cho việc thực hiện các nghiên cứu tiếp về các loại đột biến khác ở gen LMP1 EBV, cũng như xác định type gen HLA ở BN UTVMH.

- Sử dụng làm tài liệu tham khảo và học thuật cho sinh viên bậc đại học và học viên sau đại học tại các cơ sở đào tạo khi nghiên cứu về lĩnh vực này.

3.2. Các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

- Cần tiếp tục nghiên cứu về các kiểu đột biến khác, ngoài kiểu đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 EBV của BN UTVMH tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long.

- Cần thực hiện nghiên cứu với cở mẫu lớn hơn và đi sâu phân tích về vai trò của các alen HLA liên quan đến trình diện nhóm quyết định kháng nguyên (epitope) của LMP1 EBV trong bệnh sinh học UTVMH ở bệnh nhân UTVMH vùng Đồng bằng sông Cửu Long, miền Nam của Việt Nam.

1. Summary

          Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a malignant tumor originated mainly from the epithelial cell lining the nasopharynx with different degrees of differentiation. The disease is often diagnosed late for a variety of reasons and as a result, in poorer treatment outcomes and increased mortality. Previous studies have demonstrated that, among the main pathogenic factors, Epstein-Barr virus (EBV) infection is considered to be the decisive factor in the pathogenesis of NPC and should be paid the most attention to research, especially, the Latent Membrane Protein 1 (LMP1) gene of EBV is found in most nasopharynx biopsy tissue of NPC patients. The loss of 30bp mutation of the LMP1 EBV gene is strongly associated with malignant tumors growing in the nasopharynx epithelium in patients with EBV infection. In addition, the characteristics of NPC, it is also related to the factor of the Human Leucocyte Antigen (HLA) genotype, the sensibility gene to NPC, and this is can make the different incidence of diseases among regions. The objectives of the study were to determine the rate of the presence and loss of 30bp mutation of the LMP1 EBV gene in biopsy tissue samples of NPC patients and to figure out the prevalence of HLA alleles genotype in studied patients. A cross-sectional descriptive study was carried out of 108 nasopharynx biopsy samples in patients diagnosed with nasopharyngeal carcinoma at Can Tho Oncology Hospital. Classical PCR technique was implemented utilizing primer pair LMP1 (168373-168174) to detect the LMP1 gene and the LMP1 gene sequencing technique was also done to ascertain the LMP1 EBV gene mutation type.

          The results showed that the rate of LMP1 EBV gene presence was 64.8% (70/108) and the loss of 30bp mutation in the LMP1 gene accounted for 72.9% (51/70) by PCR technique. This result has confirmed by gene sequencing technique and it is had have 75.8% (25/33) of loss 30bp mutation in the LMP1 gene. The site of loss 30bp gene LMP1 EBV mutation was 168266-168295 and it is founded on some nucleotide replacement in mutations such as 168225A>T, 168295T>A, 168308A>G, 168320T>C.

         By Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide probes (PCR-SSO) genotyping technique, the study has determined the frequencies of HLA alleles in patients that were -A*02 (40.4%), -A*11 (21.2%), -A*24 (21.2%); -B*15 (25%), -B*46 (23.1%), -B*38 (9.6%), -B*07 (7.7%); -DRB1*12 (17.3%) and -DRB1*09 (13.8%); -DQB1*03 (44.7%), -DQB1*05 (21.4%) and -DQB1*06 (17.9%); -DQA1*01 (35.7%), -DQA1*03 (28.6%) and -DQA1*06 (21.4%). People who carried the allele -DRB1*08 are at risk for NPC eight times more than normal people (OR = 8.098, p < 0.05), whereas, people who carried the allele -DRB1*12 and -DQB1*03 can reduce 33,5% and 36,7% respectively the risk of this disease (OR= 0.335, p<0.05; OR= 0.367, p<0.05) compared to people without these alleles. There are the relationships statistically significant (p < 0.05) between 30bp loss mutation in LMP1 EBV gene with undifferentiated carcinoma type of NPC patients, but there is not found its relation to the stage of disease. HLA-B*15 allele was an allele that can risk of loss 30bp mutation LMP1 EBV gene four times more than people without these alleles (with OR = 4.640, p = 0.018). Particularly for HLA-A*02 allele was correlated with undifferentiated carcinoma (p < 0.05). HLA-B*15 and HLA-DQA1*03 alleles can reduce the risk of late stage of disease by 12.2% and 17.8%

2. Contributions of the thesis: The thesis is the first study on pathogenesis mechanisms of NPC in the Mekong Delta, The South of Vietnam in general and Can Tho city in particular. This study provided scientific data on the rate of the presence and loss of 30bp mutation of the LMP1 EBV gene in biopsy tissue samples of NPC patients, the frequency of all common HLA alleles genotype of patients by PCR-SSO technique.
3. Practical applications and future research directions

3.1. Practical applications: The application of the PCR technique to help to identify the loss 30bp mutation of the LMP1 EBV gene in biopsy tissue samples of NPC patients can supplement to diagnose and prognosis NPC. In addition, the thesis also provides scientific data on the differences in histopathological types of NPC in the Mekong Delta region of Vietnam. As a basis for doing further research on other types of mutations in the LMP1 EBV gene and HLA genotype in NPC in the Mekong Delta region of Vietnam.

3.2. Future research directions: In the future, it is possible to make researches on other types of mutations more than the loss of 30bp in the LMP1 EBV gene of NPC patients in the Mekong Delta region. Also, it is possible to do research with a large sample size and in-depth analysis of the role of class I and class II HLA related to the presentation of the antigen determinant (epitope) for LMP1 EBV to make clear about the pathogenesis of NPC in regions of Vietnam.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)