Tên đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp”.

Tác giả: Lê Thế Xuân, Khóa: 2013

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản; Mã số: 62620110. Nhóm ngành: Nông-Lâm-Ngư nghiệp.

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Vũ Ngọc Út - Trường Đại học Cần Thơ.

1. Tóm tắt nội dung luận án

Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới, trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm công nghiệp tại các quốc gia này. Tác nhân gây AHPND là một số chủng Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB gây hoại tử gan tụy cấp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tính đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp. đã được phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V. parahaemolyticus đã được xác định, trong đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân gây AHPND. Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng Bacillus sp. Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B. subtilis (11 chủng), B. velezensis (8 chủng), B. siamensis (5 chủng) và B. licheniformis (2 chủng). Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để phân lập hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có hoạt tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây AHPND. Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH và độ mặn. Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND là 10⁶ cfu/mL. Khi thử nghiệm trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V. parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt là 85,56% và 76,67%. Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến 35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B. subtilis BRB2.1 không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm. Khả năng đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng. Do tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận nên chủng B. subtilis BRB2.1 có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng chống AHPND.

Từ khóa: Bacillus, đối kháng V. parahaemolyticus, AHPND, bệnh hoại tử gan tụy cấp.

2. Những kết quả mới của luận án

Luận án đã phân lập được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng gây AHPND. Phương pháp MLST đã được sử dụng thành công lần đầu tiên để phân loại Bacillus sp. có trong ao nuôi tôm công nghiệp. Kết quả cho thấy tồn tại bốn loài chính trong ao nuôi tôm công nghiệp là B. subtilis, B. siamensis, B. velezensis, và B. amyloliquefaciens.

3. Các ứng dụng/khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu

Hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có thể được ứng dụng để sản xuất chế phẩm probiotic nhằm phòng chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ.

Ngoài ra, MLST là một kĩ thuật rất ưu việt để phân loại Bacillus sp., do các trình tự 16S rDNA có tính tương đồng rất cao trong chi này.

Các vấn đề tiếp tục nghiên cứu:

- Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 để xác định toàn bộ các bacteriocin có mặt ở hai chủng vi khuẩn này.

- Xác định các loại bacteriocin liên quan đến tính đối kháng V. parahaemolyticus gây AHPND ở hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3.

- Xây dựng quy trình sản xuất các chế phẩm probiotic chứa B. subtilis BRB2.1 hoặc B. siamensis BĐK2.3.

1. Research Abstract

Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture. To date, the disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming industry in many countries (including Vietnam). The causative agent of AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB. The aim of this study was to isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V. parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps. To this end, we have isolated 149 presumptive Bacillus sp. isolates and 51 Vibrio sp. isolates from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces. By detecting toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing histological observation, we have identified 12 V. parahaemolyticus isolates, among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to be the direct cause of AHPND. Furthermore, Multi-locus Sequence Typing (MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26 Bacillus isolates. The results showed 4 major clusters, corresponding to 4 Bacillus species, namely B. subtilis (11 isolates), B. velezensis (8 isolates), B. siamensis (5 isolates) và B. licheniformis (2 isolates). Additionally, agar diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 to V. parahaemolyticus (including strain BĐB1.4v causing AHPND). These two Bacillus isolates could not only secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast range of temperature, pH and salinity. Results showed that when inoculated at 10⁶ cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V. parahaemolyticus BĐB1.4v. When tested on Litopenaeus vannamei cultured in tanks of 100L, B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 strains were proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% and 76,67% when being cultured with the two isolates). In larger model (1000L), B. subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND but also improved their food conversion rate. The antagonistic activity to V. parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene encoding for subtilosin A, which is a wide spectrum bacteriocin. Since B. subtilis is considered as GRAS, B. subtilis BRB2.1 strain could be directly used to produce probiotics that prevent AHPND in commercial shrimp ponds.

Keywords: Bacillus, antagonistic to V. parahaemolyticus, AHPND, acute hepatopancreatic necrosis disease.

2. Research Creativeness
3. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BDK2.3 have been isolated and displaying high antagonistic activities to V. parahaemolyticus, including strains causing AHPND. This is also the first study to apply Multilocus Sequence Typing in characterizing Bacillus sp. in industrial shrimp ponds in Vietnam. The results showed B. subtilis, B. siamensis, B. velezensis, and B. amyloliquefaciens as the predominant species in industrial shrimp ponds in Vietnam.
4. The applications/potential applications in barramundi farming, and the perspectives of this study

The two strains B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BDK2.3 can be applied in the production probiotics for prevention of AHPND in shrimp aquaculture.

Additionally, MLST is a powerful tool for characterizing Bacillus sp., since 16S rDNA sequences are highly similar between strains of this genus.

Issues of further research:

- The genome of B. subtilis BRB2.1 will be sequenced to identify all bacteriocin genes in this strain.

- Identify all bacteriocins related to the antagonism to V. parahaemolyticus of B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BDK2.3

- Develop probiotic products with B. subtilis BRB2.1 or B. siamensis BDK2.3 as the main ingredient.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)