Tên đề tài: “Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh”.

 Tác giả: Phạm Công Uẩn, Khóa: 2012

  Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 62420107. Nhóm ngành: Khoa học sự sống.

 Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu - Trường Đại học Cần Thơ.

1. Những đóng góp mới về mặt học thuật, lý luận của luận án

Xác định được virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3) là tác nhân chủ yếu gây ra những ổ dịch viêm gan vịt trên vịt con tại Đồng bằng sông Cửu Long. Chủng  DHAV-3 khá đồng nhất về trình tự nucleotide trong đoạn gen khảo sát và phân dòng thành một nhóm riêng biệt khi so sánh với chủng DHAV-3 khác trong nước và khu vực châu Á.

Sản xuất thành công kháng thể IgY tinh chế từ chủng DHAV-3 phân lập ở ĐBSCL và đã thử nghiệm phòng trị bệnh viêm gan vịt đạt hiệu quả trong điều kiện thí nghiệm.

2. Những luận điểm mới từ kết quả nghiên cứu của luận án

Phân lập 92 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm qua môi trường phôi vịt, có 78 mẫu gây chết phôi, chiếm tỷ lệ 84,8%. Bệnh phẩm thu từ 78 trứng chết phôi tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tế bào cho thấy, tất cả các mẫu đều gây bệnh tích tế bào. Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật RT-PCR cho thấy có 56/78 (71,79%) chủng virus phát hiện là virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3). Tỷ lệ dương tính DHAV-3 ở các tỉnh Kiên Giang, Hậu Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh lần lượt là 84,2% (16/19), 81,8% (18/22), 57,1% (8/14), 60% (6/10), 61,5% (8/14). Không phát hiện được virus viêm gan vịt type I genotype 1, genotype 2 và virus viêm gan vịt type II từ các mẫu nghiên cứu.

  Mười chủng virus viêm gan vịt đại diện (DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) được giải trình tự nucleotide và phân tích di truyền, dựa vào đoạn gen khuếch đại từ nucleotide 2.841 đến 3.081. Kết quả cho thấy 10 chủng này có độ tương đồng cao về trình tự nucleotide (98-100%) và axít amin (97-100%) và có quan hệ rất gần gũi với các chủng DHAV-NT phân lập từ Miền Trung Việt Nam và DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 phân lập từ Trung Quốc.

 Kết quả xác định độc lực và tính gây bệnh của chủng DHAV-3-HG2 trên phôi vịt và vịt con cho thấy, chủng virus này có độc lực cao, 10^8,17 ELD₅₀/0,2ml và 10^3,3LD₅₀/0,5ml. Thời gian gây chết phôi từ 18 - 78 giờ, trung bình là 24,8 ± 3,3 giờ. Phôi chết có bệnh tích đặc trưng như da phôi xuất huyết (100%), phôi còi cọc chậm phát triển (87%), gan sưng xuất huyết (78,3%), gan có màu vàng nhạt (21,8%), phôi phù tích nước (43,5%). Vịt con nhiễm bệnh biểu hiện triệu chứng điển hình như vịt ít hoặc không đi lại (77,3%); vịt bỏ ăn, ủ rũ (50,7%); trước khi chết vịt nằm nghiêng sườn hoặc co giật với tư thế đầu ngửa lên lưng (48%), thần kinh co giật (18,7%). Bệnh tích tập trung chủ yếu ở gan như gan sưng xuất huyết (100%); túi mật căng phồng (73,3%), lách sưng (63,3%). Kết quả quan sát bệnh tích vi  thể cho thấy, xuất huyết bề mặt mô gan, tế bào gan bị hư hại, tế bào bạch cầu nhiều trong mô gan. Các mẫu thận: tiểu thể Malpighi bị teo nhỏ, tế bào ống lượn gần bị hoại tử.

Kết quả gây tối miễn dịch cho gà mái đẻ bằng chủng DHAV-3-HG2 với 3 lần tiêm liều 10⁸ELD₅₀/ml, khoảng cách thời gian giữa các lần tiêm kháng nguyên là 14 ngày, gà cho đáp ứng miễn dịch tốt và ổn định với hiệu giá kháng thể IgY trong lòng đỏ đạt trung bình cao nhất đến 8,1log2. Hàm lượng IgY trong lòng đỏ trứng được xác định là 27 mg/ml và trung bình trong một trứng gà cho 63,9mg. Dịch kháng thể IgY được xác định có thể bảo vệ tế bào xơ phôi vịt khi gây nhiễm bằng virus viêm gan vịt type I genotype 3.

Kết quả thử nghiệm phòng và trị bệnh cho thấy, kháng thể IgY lòng đỏ tiêm cơ ức hiệu quả hơn đường uống và liều 50PD₅₀ có hiệu quả cao nhất trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 với tỷ lệ sống trong phòng và trị bệnh đạt trên 80% sau khi công cường độc.

Kết quả nghiên cứu cho thấy virus viêm gan vịt type I genotype 3 lưu hành phổ biến nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long. Sản xuất thành công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 và bước đầu cho thấy hiệu quả cao trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus trong  in vivo.

1. Thesis findings contribution to academic study and research

DHAV-3 is determined as the main cause of duck viral hepatitis in the Mekong Delta. DHAV-3 was quite nucleotide homogeneous and separated into 1 group compared to other DHAV-3 strains in other countries and Asia.

Successful production of purified IgY antibodies from strains DHAV-3 isolated in the Mekong Delta, and it showed effective in treatment and prevention.

2. New findings of the thesis

Seventy-eight out of 92 (84.8%) sample suspensions from internal organs of suspicious hepatitis ducklings, which were cultured in duck embryo, caused embryo dead. Seventy-eight fluid of these death embryos was continuously inoculated in duck embryo fibroblast. All of the cultured from 78 embryo fluids showed CPE lesions. The results of the identification duck hepatitis virus by RT-PCR showed that 56/78 (71.79%) virus strains identified were of type 1 genotype 3 duck hepatitis virus (DHAV-3). The DHAV-3 positive rates in Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long, and Tra Vinh provinces were 84.2% (16/19), 81.8% (18/22), 57.1%(8/14), 60%(6/10 ), 61.5%(8/14). Duck hepatitis viruses of type 1 genotype 1, genotype 2, and type 2 were not detected from these testing samples.

            Ten representative strains (DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) were sequenced and genetically analyzed, which based on a gene from 2.841 nucleotide to 3.081 nucleotides. The results showed that they were highly homologous on nucleotide (98-100%) and amino acid (97-100%) sequences. They had close relationships with strains DHAV-NT which were isolated in Viet Nam and DHAV-12-01, DHAV-BN, DHAV-Du-090905 which were isolated in China.

            The results of virulence and pathogenicity examination from strain (HG2) in duck embryo and duckling showed this strain had high virulence, 10^8.17 ELD₅₀/0.2ml and 10^3.3LD₅₀/0.5ml. Embryo death time was 18-78h, average embryo death time was 24.8 ± 3.3h. Death fetuses showed typical lesions such as hemorrhagic skin (100%), stunted embryos (87%), inflamed and hemorrhagic liver (78.3%), pale yellow liver (21.8%), edema fetus (43.5%) and pale heart muscle (21.8%). Ill ducklings showed typical symptoms such as reluctance to move (77.3%), anorexia, and suppression (50.7%). Before death, ducks convulsed with head on the final position (48%), convulsion (18.7%). The gross lesions were mainly concentrated in the liver such as hemorrhagic liver (100%), swollen gall bladder (73.3%), swollen spleen (63.3%). Microscopic examination showed bleeding in hepatic tissue surface hemorrhage, damage in hepatic tissues, a lot of white blood cells in liver tissues, atrophy Malpighi tube, necrotic proximal tubules.

            Hyper-immune to laying hens by strain DHAV-3-HG2 with three injections of 10⁸ELD₅₀/ml for each triggered maximum immune response and stable antibody level with antibody titers 8.1log2. Each ml of egg yolk contained  27 mg IgY; each egg contained an average of 63.9mg IgY antibodies. IgY antibody fluid was determined to be able to protect DEFs from DHAV-3-HG2 challenging.

            The results of prevention and treatment trials showed that produced IgY antibodies were active with the percentage of protection of 93.3% by chest intramuscular vaccination and 86.7% by the oral route, and the dose of 50 PD₅₀ showed the highest effectiveness in both duck hepatitis prevention and treatment caused by  DHAV-3 with 80% challenging ducks protected.

The study results showed that duck hepatitis virus type 1 genotype 3 was the most common type circulating in Mekong delta. IgY antibodies against DHV virus example 1 genotype three were successfully produced from chicken yolk sacs and initially showed efficiency in the prevention and treatment of duck virus hepatitis in vivo.

• Xem chi tiết nội dung luận án
• Xem thông tin đăng tải tại Website Bộ giáo dục và Đào tạo. (Nhập tên NCS vào ô tìm kiếm)