Tên đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy Diazinon trong các mô hình canh tác luân canh lúa - màu và chuyên màu ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long” .

 Tác giả: Nguyễn Văn Lẹ, Khóa 2012 đợt 1.

 Chuyên ngành: Vi sinh vật học;  Mã số: 62420107. Nhóm ngành: Khoa học sự sống.

 Người hướng dẫn chính: TS. Dương Minh Viễn, Trường Đại học Cần Thơ.

 Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Trần Nhân Dũng, Trường Đại học Cần Thơ.

1. Tóm tắt nội dung luận án

Nông dược hữu cơ thường có xu hướng lưu tồn lâu trong hệ sinh thái, trong sinh quyển và thường gây độc cho con người và môi trường. Diazinon đã cấm sử dụng đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, nông dân vẫn sử dụng thuốc trừ sâu chứa hoạt chất Diazinon để phòng trừ dịch hại cây trồng. Nhiều nghiên cứu về phân hủy sinh học Diazinon trong đất ở các vùng ôn đới, nhưng chưa có nghiên cứu về giảm thiểu ô nhiễm Diazinon trong đất vùng nhiệt đới bằng con đường sinh học. Vì thế đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu :

(1) phân lập và khảo sát khả năng phân hủy hoạt chất diazinon của các chủng vi khuẩn bản địa phân lập từ các mẫu đất được thu từ ruộng canh tác chuyên màu và luân canh lúa-màu ở ĐBSCL.

 (2) đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nồng độ diazinon đến sự gia tăng mật số vi khuẩn và tốc độ phân hủy Diazinon của một số chủng vi khuẩn tuyển chọn.

(3) xác định ảnh hưởng của cơ cấu cây trồng lên khả năng phân hủy thuốc trừ sâu diazinon ở điều kiện thực tế ngoài đồng ruộng và trong điều kiện nhà lưới.

(4) xác định sự ảnh hưởng của cơ cấu cây trồng lên cấu trúc của cộng đồng vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới.

Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy diazinon từ các mẫu đất bằng phương pháp làm giàu mật số vi khuẩn, trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung diazinon đạt nồng độ 20 ppm và tách ròng trên môi trường TSA. Xác định khả năng phân hủy diazinon của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp theo dõi hàm lượng diazinon còn lại sau 30 ngày nuôi ủ. Các dòng vi khuẩn phân hủy diazion, được định danh dựa vào trình tự gen 16Sr RNA so sánh với các trình tự nucleotide của các chủng vi khuẩn trên NCBI, xây dựng cây phả hệ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp Maximun-Likelihood. Sự thay đổi của cấu trúc cộng đồng vi khuẩn phân hủy diazinon, được xác định bằng kỹ thuật điện di biến tính tăng cấp (DGGE).

Trên mô hình chuyên màu, tổng số có 21 mẫu đất được thu tại một số địa điểm ở Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả bố trí thí nghiệm cho thấy có 10 cộng đồng vi khuẩn có khả năng phân hủy diazinon hiệu quả, giảm từ 14,3% đến 37,9% sau 14 nuôi ủ trong môi trường khoáng tối thiểu. Kết quả phân lập được 87 dòng vi khuẩn, trong đó có 15 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung diazinon có nồng độ 20 ppm. Tuy nhiên, chỉ có 4 dòng vi khuẩn ký hiệu HA7.4, TA3.2, TA4.17 và HA7.1 có khả năng phân hủy thuốc trừ sâu diazinon hiệu quả, giảm từ 15,4% đến 27,9% sau 30 ngày nuôi cấy. Mật số của bốn dòng vi khuẩn này đạt cao nhất trong điều kiện môi trường nuôi cấy như sau: ở 30^oC, pH 7, có bổ sung thêm nguồn TSB và ở nồng độ diazinon dao động từ 20 ppm–50 ppm. Các dòng vi khuẩn thể hiện khả năng phân hủy diazinon hiệu quả nhất ở nhiệt độ 30^oC với tốc độ phân hủy dao động từ 0,55-0,94%/ngày, pH 6-7 với tốc độ phân hủy từ 0,50-0,94%/ngày, ở nồng độ Diazinon 20 ppm với tốc độ phân hủy từ 0,56-0,93%/ngày và với mật số vi khuẩn ban đầu đạt 10⁶ CFU/mL có tốc độ phân hủy 0,60-0,98%/ngày.

Trên mô hình canh tác luân canh lúa–màu, tổng số có 20 mẫu đất được thu tại một số địa điểm ở Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 13 cộng đồng vi khuẩn thể hiện khả năng phân hủy diazinon, giảm từ 17,6% đến 97,8% sau 14 ngày nuôi cấy. Bên cạnh đó, 27 trong tổng số 109 chủng vi khuẩn phân lập từ 13 cộng đồng vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung diazinon đạt nồng độ 20 ppm. Tuy nhiên, chỉ có 2 dòng vi khuẩn ký hiệu CL36_M4 và BT4_L1 phân hủy hiệu quả diazinon lần lượt là 20,9% và 29,3% sau 30 ngày nuôi cấy. Mật số của hai dòng vi khuẩn CL36_M4 và BT4_L1 đạt cao nhất ở điều kiện môi trường như: 30^oC, pH 7, môi trường nuôi cấy bổ sung TSB và nồng độ diazinon từ 20–50 ppm. Hai dòng vi khuẩn CL36_M4 và BT4_L1, phân hủy diazinon hiệu quả nhất ở điều kiện môi trường như 30^oC với tốc độ phân hủy từ 0,70-1,03 %/ngày, pH 7 với tốc độ phân hủy dao động từ 0,72-1,02 %/ngày, ở nồng độ diazinon 20 ppm với tốc độ phân hủy từ 0,67-0,97 %/ngày và với mật số vi khuẩn chủng vào ban đầu ở 10⁶ CFU/mL cho tốc độ phân hủy từ 0,74-1,18 %/ngày.

Dòng vi khuẩn HA7.1 thể hiện khả năng phân hủy diazinon hiệu quả trong môi trường đất dưới điều kiện phòng thí nghiệm sau 30 ngày nuôi ủ. Các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn HA7.1 làm giảm hàm lượng diazinon và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, nghiệm thức 4: Đất không tiệt trùng và bổ sung vi khuẩn HA7.1 có hàm lượng diazinon giảm mạnh hơn so với nghiệm thức 2: Đất tiệt trùng và bổ sung vi khuẩn HA7.1, giảm tương ứng là 63,7% với tốc độ phân hủy diazinon 2,11%/ngày và 48,6% với tốc độ 1,62%/ngày.

Trên mô hình luân canh lúa màu ngoài đồng ruộng, cấu trúc của cộng đồng vi khuẩn hiếu khí phân hủy diazinon trong đất vào vụ màu chứa 3 nhóm vi khuẩn khác nhau, trong khi vụ lúa, chỉ chứa 2 nhóm vi khuẩn. Trong điều kiện nhà lưới, trên mô hình chuyên màu cấu trúc của cộng đồng vi khuẩn phân hủy diazinon trong đất được phân tách thành 6 nhóm vi khuẩn khác nhau. Trong trong mô hình luân canh lúa-màu cho thấy đất vụ màu có chứa 4 nhóm vi khuẩn khác nhau, trong khi đất trong vụ lúa chứa 3 nhóm vi khuẩn khác nhau.

Kết quả giải mã trình tự gen 16S rRNA của sáu dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4, TA3.2, TA4.17, CL36_M4 và BT4_L1 cho thấy chúng lần lượt được định danh như là Lactobacillus plantarum HA7.1, Pandoraea sp. HA7.4, Sinomonas atrocyanea TA3.2, Achromobacter xylosoxidans TA4.17, Cupriavidus sp.CL36_M4 và Achromobacter xylosoxidans BT4_L1.  

Từ khóa: Cộng đồng vi khuẩn, chuyên màu, hệ thống luân canh lúa- màu, hoạt chất Diazinon, vi khuẩn phân hủy hoạt chất Diazinon.